ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА
Учебно-методическое пособие для вузов
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2009
Стр.1
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Методы оценки интенсивности протекания процессов
свободнорадикального окисления
Определение параметров биохемилюминесценции
Определение уровня первичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Определение уровня вторичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Оценка окислительной модификации белков
Оценка степени фрагментации ДНК
Определение активности аконитатгидратазы
Методы оценки активности антиоксидантной системы
организма
Определение активности супероксиддисмутазы
и каталазы
Определение функциональной активности
глутатионовой антиоксидантной системы
Определение активности ферментов – основных
поставщиков НАДФН для работы глутатионовой
антиоксидантной системы
Определение уровня цитрата и активности
цитратсинтазы
Оценка уровня токоферола
Некоторые подходы для оценки степени развития
патологических процессов
Определение активностей ферментов – показателей
цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов
Список литературы
Приложение. Некоторые экспериментальные модели
патологических состояний
5
6
6
7
9
10
13
16
18
19
22
28
30
34
37
37
Оценка состояния энергетического обмена в ткани
головного мозга: определение уровня лактата и пирувата 46
51
60
3
Стр.3
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОТЕКАНИЯ
ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Определение параметров биохемилюминесценции
Метод биохемилюминесценции (БХЛ) может применяться в клинической
биохимии для выявления нарушений липидного обмена (гипо- и
гиперлипопротеинемий), воспалительных заболеваний, инфекционных и
онкологических заболеваний [Азизова О.А., 2001]. В клинических условиях
определение БХЛ может быть применено в нескольких направлениях:
– определение формы заболевания. При острой форме заболевания
уровень БХЛ в 5 и более раз превышает значения нормы, при
хронической только в 2–3 раза;
– оценка интенсивности СРО для системной антиоксидантной
терапии;
– определение степени тяжести болезни по динамике значений
БХЛ;
– оценка степени завершенности патологического процесса по
нормализации показателей БХЛ;
– выявление возможности летального исхода послеоперационных
больных (происходит резкое снижение интенсивности БХЛ);
– оценка безопасности проведения лазеро-, фото- и озонотерапии.
Для определения интенсивности свободнорадикальных процессов
применяют метод индуцированной БХЛ. БХЛ индуцируют пероксидом
водорода с сульфатом железа.
Принцип метода основан на том, что в представленной системе
происходит каталитическое разложение перекиси ионами металла с
переходной валентностью – Fe2+, по реакции Фентона. Образующиеся
при этом свободные радикалы (R*, ОН*, RO*, RO2
*, O2
процесс инициации свободнорадикального окисления в исследуемом
биологическом субстрате. Рекомбинация радикалов RO2
*) вступают в
* приводит к
образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением
кванта света. Интенсивность свободнорадикальных процессов определяют
на биохемилюминометре с программным обеспечением. Кинетическую
кривую БХЛ регистрируют в течение 30 с и определяют
следующие параметры: светосумму хемилюминесценции (S), интенсивность
вспышки (Imax), характеризующие интенсивность свободнорадикальных
процессов, а также величину тангенса угла наклона кривой
(tg α2), характеризующую общую антиоксидантную активность
[Кузьменко Д.Н., 1999]. Антиоксидантный потенциал обследуемой
пробы также коррелирует с коэффициентом К, определенным по от6
Стр.6
ношению Imax/S. На интенсивность исследуемого процесса оказывает
влияние полный комплекс соединений, обладающих как антиоксидантными,
так и прооксидантными действиями, то есть метод дает
возможность оценить уровень компенсаторных механизмов свободнорадикального
процесса в организме.
Среда для определения интенсивности БХЛ имеет следующий
состав: 0,4 мл 0,02 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл
0,01 мМ FeSO4, 0,2 мл 2%-го раствора пероксида водорода (вносимого
непосредственно перед измерением). Исследуемый материал вносят в
количестве 0,1 мл непосредственно перед измерением до внесения
пероксида водорода.
Определение уровня первичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Принято считать, что важнейшую роль в организме млекопитающих
играет свободнорадикальное (пероксидное) окисление липидов.
По-видимому, это связано с тем, что АФК имеют наиболее высокую
константу взаимодействия с полиненасыщенными жирными кислотами
(ПНЖК), являющимися основным структурным компонентом
фосфолипидов мембран (Владимиров Ю.А., 1972).
Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) представляет собой
процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием
перекисей, кетонов, альдегидов и других соединений. Отличительной
чертой этой реакции является ее цепной, самоиндуцирующийся
характер. Реакция протекает в несколько стадий, которые получили
название «инициирование», «продолжение», «разветвление» и
«обрыв» цепи (табл. 1).
Таблица 1
Стадия процесса
Инициация
Продолжение
Разветвление
Обрыв
Основные этапы пероксидного окисления липидов
Химические реакции
НО• + LH → Н2О + L•
L• +О2 → LOO•
LOO• + LH → LOOН + L•
Fe2+ + LOOH → Fe3+ + HO- + LO•
LO• + LH → LOH + L•; L• + O2 → LOO• и т.д.
LOO• + Fe2+ + H+ → LOOH
LOO• + AnH → An•
LOO• + LOO• → молекулярные продукты
7
Стр.7
Биологические последствия ПОЛ связаны с повреждением белковых
структур (мембранных белков) и липидного бислоя мембран в
целом. Для оценки интенсивности процессов ПОЛ в биосубстратах
используют методы определения ряда его продуктов. Так, к первичным
продуктам ПОЛ относят диеновые коньюгаты. Поскольку наиболее
легко отрывается атом водорода от углерода, находящегося в альфа-положении
по отношению к двойной связи в молекуле ненасыщенной
жирной кислоты, то при делокализации неспаренного электрона в
молекулах жирнокислотных остатков появляется система сопряженных
двойных связей, т. е. возникают конъюгированные диены. Данные
соединения легко взаимодействуют с кислородом с образованием перекисных
радикалов, а в дальнейшем и гидроперекисей. Содержание
диеновых коньюгатов определяют спектрофотометрическим методом.
Принцип метода состоит в том, что образование в молекуле полиненасыщенных
жирных кислот сопряженных двойных связей (конъюгированных
диенов) сопровождается появлением в спектре их поглощения
максимума в области 232–234 нм с плечом в области 260–280 нм,
соответствующим сопряженным кетодиенам (Стальная И.Д., 1977).
Ход работы. 0,25 мл исследуемого материала растирают в течение
15 мин в гомогенизаторе Поттера–Эльвегейма с 9 мл экстрагирующей
смеси гептана с изопропиловым спиртом в соотношении 1 : 1. Полученную
суспензию помещают в плотно закрывающиеся полиэтиленовые
пробирки. Пробы центрифугируют при 4000g в течение 10 мин.
Надосадочную жидкость переносят в градуированные пробирки и добавляют
1/10 объема дистиллированной воды. После двукратного
встряхивания и расслаивания фаз отбирают гептановую фазу. К равным
объемам по 0,5 мл приливают этиловый спирт в объемном отношении
1 : 5 – 1 : 10. Измеряют экстинкцию при 233 нм. В качестве контроля
используют пробы, содержащие только экстрагирующую фазу или вместо
1 мл супернатанта 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера (рН 7,6). Содержание
диеновых коньюгатов рассчитывают по следующей формуле:
[] общ
ДК VD ,LE V
Ч
= ЧЧ внес
где [ДК] – концентрация диеновых коньюгатов, мкМ/г; Vобщ – объем
полученного образца, мл; D – величина оптической плотности, ед.;
L – длина оптического пути, см; Е – коэффициент молярной экстинкции,
равный 2,2 Ч 105 М–1с–1; Vвнес – объем вносимой пробы, мл.
8
Стр.8