МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСТИТЕТ»
ОСНОВЫ
МЕДИЦИНСКОЙ ЦИТОЛОГИИ
Учебно-методическое пособие для вузов
Составители:
О.С. Машкина, А.В. Кокина,
В.Н. Попов
Воронеж
Издательский дом ВГУ
2017
Стр.1
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………… 4
ЗАНЯТИЕ 1. Световая микроскопия: устройство, типы, оптические данные,
правила работы с микроскопом............................................... 5
ЗАНЯТИЕ 2. Единство и разнообразие клеточных типов…............................ 10
ЗАНЯТИЕ 3. Способы изготовления препаратов для световой микроскопии. 12
ЗАНЯТИЕ 4. Техника приготовления препаратов мазков крови животных
ЗАНЯТИЕ 5. Анализ препаратов крови лабораторной крысы и человека.
Определение лейкоцитарной формулы..………………………..
ЗАНЯТИЕ 7. Методы исследования химического состава и метаболизма
клеток и тканей….………………………………………………..
ЗАНЯТИЕ 8. Измерение микроскопических объектов……………………..
ЗАНЯТИЕ 10. Ультраструктурная (субклеточная) организация клетки…...
ЗАНЯТИЕ 11. Ядро интерфазной клетки..…………………………………..
ЗАНЯТИЕ 12. Структура митотических хромосом. Понятие о кариотипе...
16
18
ЗАНЯТИЕ 6. Методы контрастирования в световой микроскопии. Конфокальный
микроскоп для цитологических исследований………. 21
25
29
ЗАНЯТИЕ 9. Электронная микроскопия как метод цитологических исследований…………………………………………………………….
31
37
43
48
ЗАНЯТИЕ 13. Кариотип человека и методы его изучения. Денверская и
Парижская классификация хромосом человека.……………….. 52
ЗАНЯТИЕ 14. Изучение кариотипа человека и диагностика наследственных
заболеваний с использованием современных молекулярноцитогенетических
методов….………………………………..
ЗАНЯТИЕ 16. Митоз – универсальный способ деления эукариотических
клеток……………………………………………………………..
ЗАНЯТИЕ 17. Клеточный цикл и его регуляция. Нарушение клеточного
цикла и онкогенез………………………………………………...
ЗАНЯТИЕ 18. Политенные хромосомы как результат «сбоя» клеточного
цикла……………………………………………………………….
ЗАНЯТИЕ 19. Патологии митоза и их последствия. Полиплоидия и анеуплоидия...............................................................................................
59
ЗАНЯТИЕ
15. Половой хроматин и его использование для диагностики
пола и аномалий в системе половых хромосом………………… 63
65
69
76
79
ЗАНЯТИЕ 20. Микроядерный тест буккального эпителия ротовой полости
для оценки состояния генетического аппарата человека….…… 83
ЗАНЯТИЕ 21. Деление клетки – мейоз. Типы мейоза………………………. 86
ЗАНЯТИЕ 22. Формирование половых клеток у человека: сперматогенез и
оогенез……………………………………………………………...
92
ЗАНЯТИЕ 23. Патологии мейоза и их последствия….……………………… 99
ЗАНЯТИЕ 24. Нарушения кариотипа человека, связанные с анеуплоидией.
Хромосомные болезни и их цитодиагностика………………….. 102
ЗАНЯТИЕ 25. Решение ситуационных задач……….……………………….. 106
ЗАНЯТИЕ 26. Апоптоз и некроз – два варианта гибели клеток.…………… 108
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА…..…………………………………….. 113
3
Стр.3
венном освещении). Для лучшего освещения объекта в биологических микроскопах
вместо зеркала используют как вынесенные перед микроскопом
(ОИ-19), так и встроенные в микроскоп осветители (у микроскопов МБИ-6,
МБИ-11, Микмед 2 (рис. 2), Primo-Star).
Рис. 1 - Устройство микроскопа
“Биолам Р” с зеркалом: 1 - основание;
2 - коробка с механизмом микрометрической
фокусировки; 3 - рукоятка
микрометрической фокусировки; 4 - рукоятка
макрометрической фокусировки;
5 - стопорный винт; 6 - центрировочный
винт; 7 - тубусодержатель; 8 - головка; 9
- монокулярная насадка; 10 - винт крепления
насадки; 11 - винт револьвера; 12 -
револьвер; 13 - предметный столик; 14 -
винт конденсора; 15-16 - корпус конденсора;
17 - откидная линза в оправе; 18 -
рукоятка конденсора; 19 - зеркало
Рис. 2 - Устройство микроскопа
Микмед 2 со встроенным осветителем:
1 - основание; 2 - кольцо полевой
диафрагмы; 3 - винт крепления
конденсора; 4 - откидная оправа; 5 -
винты, центрирующие конденсор; 6 -
конденсор; 7 - винт крепления предметного
столика; 8 - предметный столик; 9
- объективы; 10 - револьверное устройство;
11 - рифленое кольцо револьверного
устройства; 12 - окуляры; 13 - бинокулярная
насадка; 14 - винт крепления
бинокулярной насадки; 15 - штатив;
16 - рукоятка грубой (макрометрической)
фокусировки; 17 - рукоятка тонкой
(микрометрической) фокусировки;
18 - фонарь; 19 - кронштейн столика; 20
- рукоятка перемещения конденсора; 21
- кронштейн
Объективы – многолинзовые системы, одна из наиболее важных частей
микроскопа, определяющая его основные возможности. Объективы бывают
сухие и иммерсионные. Сухие объективы (7х, 9х, 20х, 40х) применяются
обычно при небольших увеличениях (от 56 до 600 раз). В этом случае
6
Стр.6
между объективом и препаратом находится слой воздуха (показатель преломления
его 1). Из-за разницы показателей преломления предметного
стекла и воздуха часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.
Поэтому сухие объективы не позволяют рассматривать слишком
мелкие объекты, для этого используют иммерсионные объективы,
дающие увеличение в 900-1350 раз. Преимущество иммерсионной системы
заключается в том, что между объектом на предметном стекле и объективом
находится среда с одинаковым показателем преломления (кедровое
масло имеет показатель преломления 1,515; вода – 1,33). Благодаря тому,
что лучи не преломляются и попадают в объектив, достигается наилучшее
освещение и хорошая видимость мельчайшего объекта.
На оправе иммерсионных объективов имеются канавки разного цвета
в зависимости от вида применяемой иммерсии. На объективе масляноиммерсионном
(“МИ” на оправе) канавка окрашена в черный цвет. В качестве
иммерсии используют вазелиновое, кедровое или другое масло. На
объективе водно-иммерсионном (“ВИ”) канавка белая. Этот объектив удобен
для изучения объектов, заключенных в воду. На объективе глицериново-иммерсионном
(“ГИ”) канавка окрашена в желтый цвет.
Увеличение объектива указано на оправе. Например, у микроскопа
МБР-1 объективы могут иметь увеличение 9х, 20х, 40х, 90х и апертуру соответственно
0,20; 0,40; 0,65; 1,25 (или 1,4).
Апертура (А) = нумерическая апертура (NA) – это величина, определяющая
способность оптической системы воспринимать то или иное количество
света (т.е. характеризует светособирающую способность объектива).
Она определяется по формуле:
A s inn
, где - половина угла линзы
объектива, т.е. угла между лучами, идущими от объекта к краям объектива,
а n – показатель преломления среды между покровным стеклом препарата и
объективом. Если между препаратом и объективом находится воздух, то
значение sinn
может достигать 0,94-0,95. Величина нумерической апертуры
является постоянной для каждого отдельного объектива и указана на
его оправе. Иммерсионные объективы имеют более высокие значения апертуры,
чем сухие, так как показатель преломления жидкости 1. Так, сухой
обектив с увеличением 40х имеет А=0,65, а водноиммерсионный объектив с
тем же увеличением – А=0,75. Наиболее высокая апертура – у масляноиммерсионных
объективов (до 1,4).
Апертурой характеризуются не только объективы, но и конденсор
микроскопа. Их величины указываются на оправе объективов и конденсора
и должны совпадать (принцип Келера). В противном случае возможности
объектива реализуются не полностью.
Главной характеристикой микроскопа как оптической системы, определяющей
ее качество, является разрешающая способность. Под разре7
Стр.7
шающей способностью объектива микроскопа (d) понимают тот наименьший
диаметр частицы, которую мы можем увидеть в микроскоп.
Разрешающая способность невооруженного глаза человека равна
примерно 0,1-0,2 мм или 100-200 мкм (1 мм = 1000 мкм). При помощи
сильной лупы можно рассматривать объекты величиной до 0,01 мм (10
мкм). Световой микроскоп может повысить (к невооруженному глазу человека)
разрешающую способность в 1000 раз. Обычно максимальная разрешающая
способность микроскопа не выше 0,2-0,35 мкм или 200-350 нм (1
мкм=1000 нм - нанометров), т.е. в световом микроскопе можно видеть частицы
размером 0,2-0,35 мкм.
Разрешающая способность объектива зависит от длины волны (чем
она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть) и от нумерической
апертуры объектива – А (чем она выше, тем выше разрешение) и
вычисляется по формуле: d 0,61 , где d – разрешающая способность
A
объектива; – длина волны используемого источника света, мкм; А – числовая
апертура. Так, при использовании объектива масляноиммерсионного
с увеличением 90х и апертурой (А) =1,4, при освещении
обычным светом =0,55 мкм, наименьший диаметр видимых частиц состав0,55мкм
0,61
ляет d
1,4
0,24мкм. Уменьшая длину волны света (используя,
например, синие светофильтры – =0,47 мкм или коротковолновый ультрафиолетовый
свет – =0,26-0,28 мкм) можно увидеть и изучить более мелкие
структуры и детали строения, чем при освещении обычным белым светом.
Каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего
расстояния. Объективы малого увеличения имеют максимальное рабочее
расстояние от объектива до препарата и наибольшее поле зрения, поэтому с
них начинают исследования, а затем переходят на объективы с большим
увеличением. При работе с микроскопом важное значение имеет толщина
покровного и предметного стекол. Качественное изображение наблюдается
при толщине покровного стекла 0,17 мм, предметного – 1,2 мм.
Окуляр устроен значительно проще объектива. Нередко он состоит
всего из двух линз. Увеличение окуляра у микроскопа обычно составляет
7х, 10х, 15х. Цифровые видеоокуляры, широко используемые в последние
годы, позволяют вывести изображение на экран монитора и провести его
компьютерную обработку, получить фотографии высокого качества.
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения
объектива (Vоб) на увеличение окуляра (Vок): V = Vоб · Vок. Если
объектив имеет увеличение 90х, а окуляр 15х, то общее увеличение равно
1350. В тех случаях, когда микроскоп снабжен бинокулярной насадкой АУ8
Стр.8
12, имеющей свое собственное увеличение (Vн), равное 1,5х, увеличение
микроскопа определяют по формуле: V= Vоб ·Vок · Vн.
Выбор окуляра в микроскопе должен производиться так, чтобы общее
увеличение микроскопа не превышало величину 1000А, т.е. предельную величину
полезного увеличения микроскопа. Например, при объективе 90х с
апертурой 1,35 полезное увеличение микроскопа будет равно 1350 раз
(10001,35) и поэтому не рекомендуется применять окуляры с увеличением
больше 15х (1350:90 = 15). Если нарушить это правило и применить окуляры
20х и более сильные, то в рассматриваемых структурах мы не увидим
дополнительных деталей, наоборот, на контурах элементов объекта из-за
явления дифракции будут заметны световые окаймления, что ухудшит изображение
и даже может привести к оптическим ошибкам.
Правила обращения с микроскопом. Работая с микроскопом, нужно
придерживаться следующих правил:
1. Микроскоп необходимо содержать в чистоте, предохранять от пыли
и сырости, толчков и царапин, соприкосновения с кислотами, щелочами,
растворителями, применяемыми при изготовлении микропрепаратов. В нерабочем
состоянии микроскоп должен быть накрыт чехлом.
2. Особое внимание надо обращать на чистоту объективов и других
оптических деталей. Нельзя касаться пальцами поверхностей линз. Оптические
поверхности окуляров, объективов и конденсоров нужно периодически
протирать марлей или мягкой салфеткой; чистой ватой, смоченной специальной
жидкостью для чистки оптических деталей.
3. При работе с объективом большого увеличения тубус передвигать
вначале макровинтом; окончательная фокусировка производится микровинтом.
Микровинт во избежание порчи винтовой нарезки поворачивать не более,
чем на один оборот в ту или другую сторону. При работе с объективом
малого увеличения тубус передвигать только макровинтом.
4. Нельзя вынимать препарат из-под объектива большого увеличения.
Это может привести к повреждению объектива и порче препарата.
5. Не оставлять микроскоп после работы на объективе большого увеличения;
револьвер следует перевести на малое увеличение.
6. Не оставлять тубус микроскопа открытым, т.е. без окуляра, так как
это приводит к накапливанию в нем пыли и загрязнению объектива.
7. Перенос микроскопа осуществляется следующим образом: правой
рукой захватывают тубусодержатель, а ножку штатива ставят на ладонь левой
руки.
ВНИМАНИЕ! Запрещается самим разбирать объективы, окуляры,
конденсор.
Материалы и оборудование. Различные марки световых микроскопов
(“Биолам”, МБР-3, МБИ-6, Микмед-2, Микмед-6, Primo-Star и др.), осветители,
цифровые видеокамеры, готовые препараты.
9
Стр.9
Ход работы. Задание 1. Ознакомиться с устройством, типами и основными
характеристиками оптической системы световых монокулярных,
бинокулярных и тринокуляных микроскопов (“Биолам”, МБР-3, МБИ-6,
Микмед-2, Микмед-6, Primo-Star).
Задание 2. Установить микроскоп в рабочее положение. Определить
общее увеличение микроскопа, используя комбинацию из объективов и
окуляров с разным увеличением.
Задание 3. Вычислить значение разрешающей способности микроскопа
при использовании низкоапертурных и высокоапертурных объективов
и освещении объекта лучами с длиной волны 0,55 мкм и 0,47 мкм. Полученные
результаты занести в табл. 1. Сделать вывод при использовании
каких объективов и при каком освещении наиболее высокая разрешающая
способность.
Т а б л и ц а 1
Разрешающая способность микроскопа при освещении объекта лучами
длиной волны 0.55 мкм и 0.47 мкм, использовании различных объективов
Сравниваемые
объективы
1
2
3
Объектив
0,65
1,4
0,65
0,75
1,2
1,4
Разрешающая способность при
длине волны (λ), мкм
увеличение апертура (А) λ = 0.55 мкм
40х
90х
40х
40х
60х
90х
λ = 0.47 мкм
Задание 4. Ознакомиться с возможностями использования цифровых
видеокамер для регистрации изображений.
ЗАНЯТИЕ 2. Единство и разнообразие клеточных типов
Цель занятия: 1. Ознакомление с основными типами организации
клеток (прокариотические и эукариотические), единством и разнообразием
клеточных типов у эукариот. 2. Изучить сходства и отличия строения животной
и растительной клетки. 3. Показать многообразие морфологии клеток
животных и человека и ее связь с выполняемыми функциями.
Основные теоретические положения.
Клетка – элементарная (наименьшая) единица строения, функционирования,
развития и воспроизведения живых организмов. Существует два
основных типа клеток, различающихся по организации генетического материала:
прокариотические (доядерные) и эукариотические (собственно ядерные).
Прокариоты (бактерии, цианобактерии и микоплазмы) - преимущест10
Стр.10