МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
Н.В. Селиванова,
Д.Н. Федорин,
А.Т. Епринцев
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ
ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА И ЦТК
Учебно-методическое пособие для вузов
(практикум)
Воронеж
Издательский дом ВГУ
2014
1
Стр.1
Содержание
Введение ................................................................................................................. 5
Раздел I. Выделение и количественное определение белка ............................. 6
Работа 1. Определение концентрации белка биуретовым методом .......... 7
Работа 2. Определение концентрации белка микробиуретовым
методом ........................................................................................................... 8
Работа 3. Определение белка по Лоури ........................................................ 9
Работа 4. Количественное определение белка по методу Бредфорда ..... 10
Работа 5. Спектрофотометрический метод определения белка ............... 11
Раздел II. Выделение, очистка и определение активности ферментов
глиоксилатного цикла и ЦТК ............................................................................. 12
Работа 6. Выделение, очистка и определение активности
аконитатгидратазы ........................................................................................ 14
Работа 7. Выделение, очистка и определение активности
изоцитратдегидрогеназы .............................................................................. 16
Работа 8. Выделение, очистка и определение активности
изоцитратлиазы ............................................................................................. 18
Работа 9. Выделение, очистка и определение активности
малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) .............................................................. 20
Работа 10. Выделение, очистка и определение активности
малатсинтазы ................................................................................................. 22
Работа 11. Выделение, очистка и определение активности
сукцинатдегидрогеназы ................................................................................ 24
Работа 12. Выделение, очистка и определение активности
фумаратгидратазы ......................................................................................... 27
Раздел III. Определение субклеточной локализации ферментов ................... 28
Работа 13. Разрушение клеточных структур .............................................. 31
Работа 14. Дифференциальное центрифугирование гомогената ............. 33
Работа 15. Выделение интактных митохондрий ........................................ 34
3
Стр.3
ет образование определенного количества вещества в минуту, и т.д. Тогда
удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного
препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).
2. Для целей определения ферментов могут быть использованы не только
измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции – спектрофлюорометрические
методы. Такое определение активности фермента в
ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы
на целый порядок величины. Некоторые коферменты и субстраты обладают
сильной флюоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии
имеют сильную флюоресценцию и не флюоресцируют в окисленном состоянии.
Поэтому спектрофлюорометрию используют для изучения кинетики и
механизма действия никотинамидных и флавиновых ферментов.
3. В основе колориметрических (фотометрических) методов лежит
измерение при помощи визуального или фотоэлектрического колориметра
окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии субстрата или
продукта действия фермента со специфическими реактивами, которые
обычно добавляются в фиксированную опытную пробу, взятую после остановки
ферментативной реакции. Данные методы весьма разнообразны.
4. Манометрические методы используются при определении активности
фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов
находится в газообразном состоянии. К таким реакциям относится
главным образом те, которые связаны с процессами окисления и декарбоксилирования,
сопровождающимися поглощением или выделением кислорода
и углекислоты, а также реакции, в которых выделение или связывание
газа происходит в результате взаимодействия продуктов ферментативного
превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение за ходом
реакции во времени проводится в специальных приборах – манометрических
аппаратах Варбурга.
5. Другие методы. Сюда относится обширный ряд методов, включающих
поляриметрию, вискозиметрию, потенцио- и кондуктометрические
измерения и т.п. Также определение активности можно выполнять, используя
методы хроматографии и электрофореза на бумаге. Эти методы высокочувствительны
и специфичны, что делает их во многих случаях незаменимыми;
они позволяют значительно сократить расход фермента на измерение
активности, но не всегда применимы ввиду продолжительности разделения
веществ в процессе хроматографии (и электрофореза).
Раздел I. Выделение и количественное определение белка
Белки (протеины, полипептиды) – высокомолекулярные органические
вещества, состоящие из соединенных в цепочку пептидной связью альфааминокислот.
В живых организмах аминокислотный состав белков определя6
Стр.6
ется генетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется
20 стандартных аминокислот. Множество их комбинаций дают большое
разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислоты в составе
белка часто подвергаются посттрансляционным модификациям, которые
могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою функцию, и
во время его «работы» в клетке. Часто в живых организмах несколько молекул
белков образуют сложные комплексы, например, фотосинтетический
комплекс.
Функции белков в клетках живых организмов более разнообразны,
чем функции других биополимеров – полисахаридов и ДНК. Так, белкиферменты
катализируют протекание биохимических реакций и играют важную
роль в обмене веществ. Некоторые белки выполняют структурную или
механическую функцию, образуя цитоскелет, поддерживающий форму клеток.
Также белки играют важную роль в сигнальных системах клеток, при
иммунном ответе и в клеточном цикле.
Как правило, белки сохраняют структуру и, следовательно, физикохимические
свойства, например, растворимость в условиях, таких как температура
и pH, к которым приспособлен данный организм. Резкое изменение
этих условий, например, нагревание или обработка белка кислотой или щелочью
приводит к потере четвертичной, третичной и вторичной структур
белка, называемой денатурацией. Самый известный случай денатурации белка
в быту – это приготовление куриного яйца, когда под воздействием высокой
температуры растворимый в воде прозрачный белок овальбумин становится
плотным, нерастворимым и непрозрачным. Денатурация в некоторых
случаях обратима, как в случае осаждения (преципитации) водорастворимых
белков с помощью солей аммония, и используется как способ их очистки.
Работа 1. Определение концентрации белка биуретовым методом
Основы метода
Биуретовый метод – один из колориметрических методов количественного
определения белков в растворе. Разработан в 1949 году Горналлом,
Бардавиллом и Дэвидом, ныне мало используется в биохимической лабораторной
практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за
низкой чувствительности. Основан на образовании биуретового комплекса
(имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами
меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из
KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся
комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами
– электростатическими. Полноценный комплекс образуется
лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность
раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют
при 540–560 нм.
7
Стр.7
К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к
посторонним веществам, невысокую погрешность.
Чувствительность метода – 2–10 мг/мл.
Оборудование, реактивы, материалы
ФЭК; градуированные пипетки на 1 и 5 мл; карандаш по стеклу; пробирки.
Биуретовый реактив: растворяют в 250 мл воды 0,75 г CuSO4 · 5H2O
и 3 г виннокислого натрия-калия (Na · KC4H4O6 · 4H2O), затем при энергичном
помешивании добавляют 150 мл 10%-го раствора NaOH, свободного от
Na2CO3, и 1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления;
объем доводят водой до 1 л. Материалы: 1%-й водный раствор яичного альбумина;
плазма крови в разведении 1 : 200.
Ход работы
К 1 мл исследуемого раствора, содержащего 1–10 мг белка, прибавляют
4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют стоять 30 мин
при комнатной температуре. По истечении указанного времени колориметрируют
при длине волны 540 нм против воды. Содержание белка рассчитывают
по калибровочному графику, составленному для альбумина: в серию
пробирок вливают 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мл 0,1%-го водного раствора
яичного альбумина, содержащего от 1 до 10 мг белка, доводят объем раствора
дистиллированной водой до 1 мл, перемешивают, добавляют в каждую
пробирку по 4 мл биуретового реактива, перемешивают и через 30 мин
колориметрируют.
Рис. 1. Калибровочный график для определения содержания белка.
Е – оптическая плотность, С – количество белка, мкг
связей с Cu2+ в щелочной среде. В результате реакции образуется комплекс,
окрашенный в фиолетовый цвет.
Работа 2. Определение концентрации белка микробиуретовым методом
Основы метода
Микробиуретовый метод – основан на взаимодействии пептидных
8
Стр.8