ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
БИОФИЗИКА
Практикум для студентов
Составители:
О.В. Башарина,
В.Г. Артюхов
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2009
Стр.1
Введение
Биофизика – важнейший раздел современной биологии, представляющий
собой неотъемлемую часть профессиональной подготовки студентов биологических,
медицинских, фармацевтических и других специальностей вузов. Она изучает
элементарные взаимодействия и превращения ионов и молекул, лежащие в
основе биологических процессов и явлений.
Основными разделами биофизики являются:
• квантовая биофизика, которая рассматривает электронную структуру
биомолекул, механизмы поглощения квантов света атомами и молекулами, миграцию
энергии, фотохимические реакции, лежащие в основе фотобиологических
процессов;
• молекулярная биофизика, изучающая структурную организацию и механизмы
функционирования биомакромолекул и их комплексов;
• биофизика клеточных процессов, изучающая физико-химические основы
процессов, протекающих в отдельных клеточных системах, в том числе
формирование электрических потенциалов, механизм транспортных процессов,
закономерности взаимодействия лигандов с клеточными рецепторами;
• биофизика сложных систем, включающая важнейшие разделы биофизической
науки, в том числе термодинамику и кинетику биопроцессов;
• радиационная биофизика, исследующая процессы взаимодействия ионизирующего
излучения с биосистемами, развитие лучевого поражения на молекулярном,
клеточном и организменном уровнях;
• прикладная биофизика, которая рассматривает вопросы, связанные с
практическим приложением положений, понятий, законов, моделей и методов
биофизической науки.
Для подготовки квалифицированных провизоров, обладающих высоким
интеллектуальным уровнем творческого характера в решении профессиональных
задач, необходимо постоянное совершенствование учебного процесса на основе
фундаментализации знаний. С другой стороны, знания, умения и навыки по
фундаментальным дисциплинам представляют собой ценность для будущего
специалиста только тогда, когда они вписываются как элемент в систему знаний
по данной специальности. Именно для решения названной проблемы нам представлялось
необходимым издание «Практикума по биофизике», переработанного
и дополненного с учетом профессиональной направленности для студентов фармацевтического
факультета.
В настоящее время биофизика как комплексная самостоятельная дисциплина
изучается на фармацевтическом факультете ВГУ на II курсе (3 семестр) (во
2-ом семестре – на заочной форме обучения): учебным планом предусмотрены
лекции (36 часов) и лабораторные занятия в таком же объеме. Практикум включает
пять тем, в каждой из них содержится теоретическая часть, подробное
описание физико-химических основ методов анализа, устройство приборов и
3
Стр.3
можно связать с определенными электронными переходами, обусловленными
строением молекулы исследуемого вещества. Это позволяет по спектрам
поглощения в видимой и УФ-области получать качественную информацию
о наличии определенных групп атомов в молекулах данного вещества,
о его структурном состоянии. Эти методы применяют также для определения
концентраций поглощающего вещества в растворе. В фармацевтическом
анализе они используются для установления структуры, идентификации,
оценки чистоты, количественного определения лекарственных веществ
в индивидуальном виде и в лекарственных формах.
Для характеристики поглощающей способности вещества используют
такие величины, как оптическая плотность, светопропускание и светопоглощение.
Оптическая
плотность (D) – это десятичный логарифм отношения
интенсивности света, падающего на образец (Io), к интенсивности света,
выходящего из образца (I):
D = lgI0/I.
из образца, к интенсивности света, падающего на него:
Т = I/I0.
величиной светопропускания:
центах.
(1.1)
Оптическая плотность является безразмерной величиной.
Светопропускание (Т) – отношение интенсивности света, вышедшего
(1.2)
Светопоглощение (α) – величина, равная разности между единицей и
α = 1–Т
(1.3)
Светопоглощение и светопропускание измеряются в долях или в проПоглощение
света проявляется в ослаблении светового потока после
его прохождения через исследуемый объект. Эта закономерность выражается
законом Бугера–Ламберта–Бера:
Если интенсивность падающего монохроматического светового потока
равна I0, то интенсивность света после поглощения слоем вещества будет
равняться
I = I010–εСl,
(1.4)
где ε – молярный коэффициент экстинкции (поглощения), (л•(моль•см)–1);
С– концентрация вещества (моль/л); l – длина оптического пути (толщина
слоя вещества), (см).
6
Стр.6
Коэффициент экстинкции характеризует способность молекул вещества
поглощать свет определенной длины волны и определяется структурными
особенностями молекул данного вещества, соответствует величине
оптической плотности раствора с концентрацией 1 моль/л при длине оптического
пути 1 см.
Важнейшим следствием из закона Бугера–Ламберта–Бера является
следующее положение: оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации
вещества:
D = εCl.
(1.5)
Закон Бугера–Ламберта–Бера выведен для достаточно разбавленных
растворов при использовании монохроматического света. Значительные отклонения
от закона могут быть обусловлены:
1) свойствами анализируемого образца – способностью молекул вещества
при больших концентрациях образовывать агрегаты, что приводит к
росту светорассеяния и кажущемуся повышению его оптической плотности
(рис. 1.1, кривая 2). Поэтому фотометрируемый раствор должен оставаться
истинно молекулярным во всем интервале исследуемых концентраций. Если
это условие не соблюдается, необходимо перейти в область более низких
концентраций или применять защитные коллоиды, препятствующие образованию
твердой фазы, или же изменить схему всего процесса измерения
спектральных свойств образца;
2) конструкцией прибора: при использовании немонохроматического
пучка света (например, при работе на фотоэлектроколориметрах с светофильтрами)
(рис. 1.1, кривая 3), а также при работе в области, где погрешность
прибора максимальна (см. раздел 1.2).
Рис. 1.1. Зависимость оптической плотности от концентрации вещества:
1 – при подчинении закону Бугера–Ламберта–Бера; 2 – при положительном
отклонении; 3 – при отрицательном отклонении
7
Стр.7
Спектр поглощения – это график зависимости оптической плотности
(или коэффициента экстинкции) от длины волны света, падающего на объект.
При этом по оси ординат откладывают D (или ε), а по оси абсцисс –
длину волны измерения (нм).
При одноэлектронном переходе зависимость D (или ε) от λ обычно
описывается кривой распределения Гаусса. Полоса поглощения в спектре
характеризуется тремя основными параметрами:
– максимальным значением оптической плотности (Dmax) или молярного
коэффициента экстинкции (εmax) (максимум поглощения);
– длиной волны максимального поглощения (λmax, нм), соответствующей
Dmax;
– эффективной шириной полосы поглощения ∆λ½, нм (или полушириной
полосы поглощения), она соответствует расстоянию между двумя точками
полосы поглощения, находящимися на высоте, равной половине максимальной
(½Dmax). Она измеряется в нм.
Таким образом, при интерпретации спектров поглощения необходимо
указывать положение полос поглощения, их интенсивность (Dmax) и полуширину.
Поглощение
света осуществляется не всей молекулой, а определенными
ее участками. Хромофоры – это отдельные группы атомов в молекуле
вещества, поглощающие кванты света. Основными хромофорами в белках
являются пептидные группы, ароматические (тирозин, триптофан, фенилаланин)
и серосодержащие аминокислоты (цистин, цистеин, метионин). В
нуклеиновых кислотах хромофоры – пуриновые и пиримидиновые азотистые
основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил). Указанные хромофоры
поглощают в УФ-области спектра.
Однокомпонентные неокрашенные белки (сывороточный и яичный
альбумины, трипсин, пепсин, глобулины и др.) не поглощают свет в видимом
диапазоне (400–700 нм).
Хромофорами сложных белков, в частности гемопротеидов, в видимой
области являются гемовые группы. Так, благодаря железопорфирину в
составе гембелка раствор оксигемоглобина обнаруживает несколько максимумов
поглощения в этой области спектра: самый значительный (интенсивный)
в области 412–414 нм (полоса Соре) и максимумы меньшей интенсивности
при 542 и 578 нм.
Поглощение видимого и УФ-света происходит главным образом с
участием π- и n-электронов (π-π*– и n-π*– переходы). Чем длиннее система
сопряженных связей в молекуле, тем при большей длине волны располагается
максимум поглощения.
Спектры поглощения применяются для качественного (установления
структуры, подлинности, чистоты) и количественного (выбор аналитических
длин волн) анализа лекарственных средств.
8
Стр.8