МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
ПРАКТИКУМ
ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
Учебно-методическое пособие
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2012
Стр.1
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 5
БЕЛКИ И ИХ СВОЙСТВА .................................................................................. 5
Работа 1. Цветные реакции на белки .................................................................. 7
Работа 2. Осаждение белков ................................................................................ 8
Работа 3. Определение изоэлектрической точки белков .................................. 9
Работа 4. Определение содержания общего белка в сыворотке крови ......... 11
Работа 5. Очистка растворов высокомолекулярных веществ от солей
методом гель-фильтрации на сефадексе G-25 ................................................. 15
ФЕРМЕНТЫ ........................................................................................................ 16
Работа 6. Влияние температуры, активаторов и ингибиторов
на скорость ферментативной биохимической реакции.
Определение специфичности амилазы слюны ................................................ 18
Работа 7. Определение константы Михаэлиса и максимальной скорости
ферментативной реакции ................................................................................... 20
Работа 8. Определение типа ингибирования .................................................... 22
Работа 9. Ферменты поджелудочной железы.
Определение активности амилазы в сыворотке крови .................................... 23
Работа 10. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке
крови ..................................................................................................................... 28
Работа 11. Определение активности МВ-креатинкиназы
в сыворотке крови ............................................................................................... 34
УГЛЕВОДЫ ......................................................................................................... 36
Работа 12. Метаболизм глюкозы в организме человека
и его нарушения. Определение концентрации глюкозы
в сыворотке крови и моче ................................................................................... 39
Работа 13. Количественное определение пировиноградной кислоты
в крови колориметрическим методом (по Умбрайту) ..................................... 45
Работа 14. Определение концентрации лактата в сыворотке крови .............. 46
ЛИПИДЫ ............................................................................................................. 48
Работа 15. Идентификация непредельных жирных кислот в жире ............... 50
Работа 16. Качественные реакции на кетоновые тела в моче ........................ 51
Работа 17. Обмен холестерина в организме человека и его нарушения.
Определение концентрации холестерина в сыворотке крови ........................ 52
Работа 18. Определение концентрации холестерина липопротеидов
высокой плотности в сыворотке (плазме) крови ............................................. 59
Работа 19. Определение концентрации холестерина липопротеидов
низкой плотности в сыворотке (плазме) крови ................................................ 60
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ........................................................................... 62
Работа 20. Выделение и изучение химического состава дезоксирибонуклеопротеина
из ткани селезенки .............................................................................. 63
3
Стр.3
Белки обладают разнообразной структурой. Различают четыре уровня
структурной организации белков: первичную, вторичную, третичную и четвертичную
структуры. К первичной структуре белка относится аминокислотный
состав, т.е. количество аминокислотных остатков, характер их связи
и последовательность их расположения, характерная для данного белка.
Первичная структура обеспечивается ковалентными пептидными связями.
Вторичная структура – регулярное размещение сегментов остова полипептидной
цепи без учета конформации боковых цепей аминокислотных остатков.
Известны три типа вторичной структуры: α-спираль, β-складчатый слой и
беспорядочный клубок. α-Спираль – это спиральное строение в виде винтовой
лестницы, где каждая ступень – определенная аминокислота. Витки спирали
соединены между собой непрочными водородными связями -СО⋅⋅⋅⋅⋅НN-, возникающими
между карбонильным кислородом и иминным азотом, принадлежащим
той же самой полипептидной цепи.
В β-складчатом слое две или более полипептидные цепи сложены
зигзагом так, что их сегменты находятся вблизи друг от друга в параллельной
или антипараллельной ориентации, причем соседние сегменты соединены
водородными связями. Беспорядочный клубок – участки, которые
нельзя отнести ни к α-спирали, ни к β-складчатому слою.
Третичная структура – расположение всех ковалентно связанных атомов
данной полипептидной цепи в пространстве без учета взаимодействия с
другими субъединицами. В формировании третичной структуры участвуют
дисульфидные, псевдопептидные, ионные, водородные, вандерваальсовы и
гидрофобные взаимодействия, обусловленные неполярными боковыми
группами пептидных цепей.
Аминокислотная последовательность во внешних α-спиралях часто
характеризуется периодичностью. Каждое третье или четвертое положение
в них занимает аминокислота с неполярными боковыми группами, направленными
внутрь глобулы, а остальные, как правило, полярны и обращены в
сторону водной среды.
У крупных белков (более 200 аминокислотных остатков) может быть
промежуточный уровень организации – домены. Домены – фрагменты полипептидной
цепи, сходные по своим свойствам с самостоятельными глобулярными
белками.
Четвертичная структура имеется только у белков, содержащих две
или более пептидные цепи, которые образуют за счет слабых взаимодействий
единую функционально активную белковую молекулу. Поэтому под
четвертичной структурой подразумевают размещение субъединиц в пространстве
со всей совокупностью контактов между ними. При возникновении
этого уровня организации сохраняется потенциальная возможность
разъединения субъединиц.
Для обнаружения белков существует две группы реакций: цветные
реакции и реакции осаждения.
6
Стр.6
Работа 1. Цветные реакции на белки
1. Биуретовая реакция: обусловлена наличием пептидных связей в белках
и полипептидах, благодаря которым в щелочной среде с солями меди образуют
Cu-Nа-комплексную соль полипептидов и белков сине-фиолетового
цвета. К 1 мл раствора белка добавляют 1 мл 10%-го раствора NaOH и 1–2 капли
1%-го раствора CuSO4. Появляется фиолетовое окрашивание.
2. Ксантопротеиновая реакция основана на способности присутствующих
в молекуле белка ароматических аминокислот (тирозина, триптофана
и фенилаланина) образовывать с концентрированной азотной кислотой
при подогревании желтоокрашенные нитросоединения. К 1 мл раствора
белка приливают 0,5 мл концентрированной HNO3. Выпадает осадок, который
при подогревании частично растворяется, при этом раствор приобретает
желтую окраску. Если после охлаждения в пробирку добавить 1 мл концентрированного
раствора аммиака, то желтое окрашивание переходит в
оранжевое вследствие превращения нитропроизводных циклических аминокислот
в соли хиноидной структуры. Фенилаланин лучше нитруется при
добавлении смеси концентрированных НNО3 и H2SO4.
3. Реакция на триптофан. К 1 мл раствора белка приливают 2 мл
концентрированной НСl и нагревают, не доводя до кипения, чтобы не улетучился
хлористый водород. Осадок, выпавший при добавлении кислоты,
при подогревании растворяется, и жидкость окрашивается в фиолетовый
цвет. Эта реакция указывает на наличие в яичном белке не только триптофана,
но и углеводов: триптофан реагирует с оксиметилфурфуролом, образующимся
из моносахаридов, в результате чего возникает фиолетовокрасное
соединение.
4. Реакция с ацетатом свинца. Положительная реакция указывает на
наличие в белковой молекуле атомов серы цистеина и цистина. К 1 мл раствора
белка добавляют 2 мл 1%-го NaOH, перемешивают, кипятят 2–3 мин,
затем прибавляют 1–2 капли 5%-го (CH3COO)2Pb и продолжают нагревать до
выпадения черного осадка PbS. Реакция идет по следующему уравнению:
R-SH + 2NaOH → Na2S + R-OH + H2O
Na2S + (CH3COO)2Pb → РbS + 2СН3СОONa
5. Нингидриновая реакция указывает на присутствие в аминокислотах
α-аминогрупп. При этом происходит выделение СО2. К 0,2–0,5 мл раствора
аминокислот прибавляют 2–3 капли 0,1%-го ацетонового раствора нингидрина,
кипятят 2 мин. Появляется сине-фиолетовое окрашенное соединение
вследствие взаимодействия двух молекул нингидрина с аминокислотой.
6. Реакция Шульце – Распайля обусловлена наличием в белке остатков
триптофана. Эта аминокислота, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом,
дает продукты конденсации, окрашенные в вишнево-красный цвет.
Оксиметилфурфурол в этой реакции образуется из гексоз (быстрее из
7
Стр.7
фруктозы), получающихся при гидролизе сахарозы под влиянием концентрированной
Н2SO4. К 1 капле неразбавленного яичного белка добавляют
1–2 капли 10%-го раствора сахарозы и пипеткой осторожно подслаивают
около 1 мл концентрированной Н2SO4. Легким встряхиванием пробирки
смешивают обе жидкости, появляется вишнево-красное окрашивание. Реакция
идет с выделением тепла.
Работа 2. Осаждение белков
Характерным свойством белковых веществ является их способность
осаждаться из растворов под воздействием различных факторов среды.
Осаждение белков нейтральными солями («высаливание»), например
(NH4)2SO4, NaCl, Nа2SO4, нашло широкое применение в их очистке, поскольку
после удаления соли белки восстанавливают свои биологические
функции. Осаждение белков при высаливании происходит вследствие дегидратации
молекул белков в присутствии ионов соли, конкурирующих с
белками за молекулы воды. Сильной гидратационной способностью обладают
также некоторые органические растворители. При нагревании белков,
добавлении солей тяжелых металлов, экстремальных значениях рН и действии
других факторов белки выпадают в осадок вследствие денатурации.
Под денатурацией понимают негидролитическое разрушение белковой молекулы
с деградацией ее вторичной и третичной структур. При этом ковалентная
структура не претерпевает изменений, но биологическая функция у
большинства белков утрачивается. Реакции осаждения белков используют в
биохимической практике для удаления белковых веществ и для определения
их содержания в биологическом материале (например, моче).
1. Осаждение белков кипячением. В пробирку наливают 1 мл раствора
белка и нагревают до кипения. Происходит денатурация белка. Более полное
осаждение белка достигается слабым подкислением его уксусной кислотой
или добавлением других электролитов: в 1 мл раствора белка добавляют
1–2 капли 1%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Выпадает
осадок белка. Явление денатурации (потеря нативных свойств) вызывается
глубокими нарушениями структуры белка.
2. Осаждение белков солями тяжелых металлов. Белки при взаимодействии
с солями тяжелых металлов адсорбируют их, образуя нерастворимые
солеобразные и комплексные соединения.
К 1 мл раствора белка приливают по каплям 5%-й раствор CuSO4. Появляется
осадок, растворяющийся в избытке реактива.
К 1 мл белка приливают по каплям 5%-й раствор ацетата свинца. Появляется
осадок, растворяющийся в избытке реактива.
3. Осаждение белков реактивами на алкалоиды. К группе реактивов на
алкалоиды принадлежит таннин, пикриновая кислота, железисто-синеро8
Стр.8