Национальный цифровой ресурс Руконт - межотраслевая электронная библиотека (ЭБС) на базе технологии Контекстум (всего произведений: 508624)
Консорциум Контекстум Информационная технология сбора цифрового контента
Уважаемые СТУДЕНТЫ и СОТРУДНИКИ ВУЗов, использующие нашу ЭБС. Рекомендуем использовать новую версию сайта.

Культура животных клеток (1800,00 руб.)

0   0
Первый авторФрешни Р. Я.
АвторыХомяков Ю. Н., Хомякова Т. И.
ИздательствоМ.: Лаборатория знаний
Страниц791
ID642065
АннотацияУчебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области, содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого оборудования, включая лабораторный дизайн. В достаточном объеме освещены вопросы техники безопасности. Подробно обсуждаются методика подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для манипуляций с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна для использования как руководство в лаборатории.
Кому рекомендованоДля студентов-биологов, биотехнологов, медиков, а также исследователей, специалистов биофармацевтических центров и сотрудников диагностических лабораторий.
ISBN978-5-00101-557-4
УДК57.08
ББК28.03
Фрешни, Р.Я. Культура животных клеток = Culture of Animal Cells [Электронный ресурс] : практ. руководство / пер.: Ю.Н. Хомяков, пер.: Т.И. Хомякова, Р.Я. Фрешни .— 4-е изд., испр. и доп. (эл.) .— М. : Лаборатория знаний, 2018 .— 791 с. : ил. — Пер. 6-го англ. изд.; [28] с. цв. вкл.; Деривативное эл. изд. на основе печ. аналога (М.: Лаборатория знаний, 2018); Электрон. текстовые дан. (1 файл pdf : 791 с.); Систем. требования: Adobe Reader XI; экран 10" .— ISBN 978-5-00101-557-4 .— Режим доступа: https://rucont.ru/efd/642065

Предпросмотр (выдержки из произведения)

Культура_животных_клеток__практическое_руководство._—_4-е_изд.,_испр._и_доп._(эл.)..pdf
Стр.4
Стр.5
Стр.6
Стр.7
Стр.8
Стр.9
Стр.10
Стр.11
Стр.12
Стр.13
Стр.14
Стр.15
Стр.16
Культура_животных_клеток__практическое_руководство._—_4-е_изд.,_испр._и_доп._(эл.)..pdf
КУЛЬТУРА ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО Р. Я. Фрешни Перевод 6-го английского издания исправленное и дополненное (электронное) 4-е издание, Лаборатория знаний 2018 Москва
Стр.4
УДК 57.08 ББК 28.03 Ф87 д-р биол. наук Ю. Н. Хомяков, канд. мед. наук Т. И. Хомякова П е р е в о д ч и к и: Фрешни Р. Я. Ф87 Культура животных клеток [Электронный ресурс] : практическое руководство / Р. Я. Фрешни ; пер. 6-го англ. изд. — 4-е изд., испр. и доп. (эл.). —Электрон. текстовые дан. (1 файл pdf : 791 с.). — М. : Лаборатория знаний, 2018. — Систем. требования: Adobe Reader XI ; экран 10". ISBN 978-5-00101-557-4 Учебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области, содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого оборудования, включая лабораторный дизайн. В достаточном объеме освещены вопросы техники безопасности. Подробно обсуждаются методика подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для манипуляций с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна для использования как руководство в лаборатории. Для студентов-биологов, биотехнологов, медиков, а также исследователей, специалистов биофармацевтических центров и сотрудников диагностических лабораторий. УДК 57.08 ББК 28.03 Деривативное электронное издание на основе печатного аналога: Культура животных клеток : практическое руководство / Р. Я. Фрешни ; пер. 6-го англ. изд. — 4-е изд., испр. и доп. — М. : Лаборатория знаний, 2018. — 760 с. : ил., [28] с. цв. вкл. — ISBN 978-5-906828-29-3. Приведенные в книге показания к применению, противопоказания и дозировки препаратов настоятельно рекомендуется сверять с информацией их производителей и соотносить с клиническими процедурами. Авторы, редакторы и издатель не несут никакой юридической ответственности за любые содержащиеся в тексте и иллюстрациях ошибки или упущения. В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков или выплаты компенсации Copyright ○c 2010 by John Wiley & Sons. Inc. All rights reserved. ISBN 978-5-00101-557-4 ○c Перевод на русский язык, оформление, Лаборатория знаний, 2015 Все права защищены. Авторизованный перевод издания на английском языке, опубликованного John Wiley & Sons Limited. Ответственность за точность перевода полностью возложена на издательство Лаборатория знаний и не является ответственностью John Wiley & Sons Limited. Никакая часть данной книги не может быть воспроизведена в любой форме без письменного разрешения первоначального правообладателя, John Wiley & Sons Limited.
Стр.5
Оглавление Список иллюстраций . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Список цветных вклеек . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Список протоколов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Список таблиц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Предисловие и благодарности . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Список сокращений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Глава 1 ВВЕДЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.1. 1.2. Исторические сведения . . . . . . . . . . . . . . . 30 Преимущества культуры ткани . . . . . . . 35 1.2.1. Контроль окружающей среды . . . . . . . . . . . 35 1.2.2. Характеристика и однородность образцов 36 1.2.3. Экономичность, эффективность и автоматизация процесса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.2.4. Моделирование in vitro условий in vivo . . . 36 1.3. Ограничения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.3.1. Наличие специальных навыков . . . . . . . . . 36 1.3.2. Затраты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 1.3.3. Дифференцировка и селекция . . . . . . . . . . 37 1.3.4. Происхождение клеток . . . . . . . . . . . . . . . . 37 1.3.5. Нестабильность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 1.4. 1.5. Основные отличия культуры in vitro . . . 38 Типы культуры ткани . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Глава 2 БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.1. 2.2. Влияние окружающей среды на культуру клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Клеточная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.2.1. Молекулы клеточной адгезии . . . . . . . . . . . 41 2.2.2. Межклеточные контакты . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.2.3. Внеклеточный матрикс . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.2.4. Цитоскелет . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.2.5. Клеточная подвижность . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.3. Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 45 2.3.1. Клеточный цикл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.3.2. Контроль клеточной пролиферации . . . . . . 46 2.4. Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.4.1. Поддержание дифференцировки . . . . . . . . 47 2.4.2. Дедифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.5. 2.6. 2.7. Передача клеточных сигналов . . . . . . . . 50 Энергетический метаболизм . . . . . . . . . . 51 Происхождение культивируемых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 2.7.1. Получение первичной культуры . . . . . . . . . 52 2.7.2. Эволюция клеточных линий . . . . . . . . . . . . 53 2.7.3. Старение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 2.7.4. Трансформация и развитие постоянных клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 Глава 3 СТРУКТУРА, ПЛАНИРОВКА И ОБОРУДОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 3.1. Планировка, меблировка и оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 3.1.1. Требования к помещениям . . . . . . . . . . . . . 57 3.1.2. Обслуживание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.1.3. Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.2. Планировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.2.1. Помещение для стерильных манипуляций 61 3.2.2. Ламинарное оборудование . . . . . . . . . . . . . 62 3.2.3. Служебный лабораторный стол . . . . . . . . . 62 3.2.4. Карантин и изоляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.2.5. Инкубация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.2.6. Зона подготовительных работ . . . . . . . . . . . 66 3.2.7. Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Глава 4 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ . . . . 70 4.1. 4.2. Потребности лаборатории культуры ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 Асептическая зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.2.1. Ламинарные шкафы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.2.2. Сервисные тележки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.2.3. Стерильные манипуляции с жидкостями — пипетирование и дозирование . . . . . . . . . . 75 4.2.4. Инвертированный микроскоп . . . . . . . . . . . 79 4.2.5. CCD-камера и монитор . . . . . . . . . . . . . . . . 79 4.2.6. Препаровальная лупа . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 4.2.7. Центрифуга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.2.8. Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.3. Инкубация и культура . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.3.1. Инкубатор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.3.2. Влажный СО2-инкубатор . . . . . . . . . . . . . . 81 4.3.3. Регистратор температуры . . . . . . . . . . . . . . 83 4.3.4. Роллерные штативы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.3.5. Магнитная мешалка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.3.6. Культуральные сосуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.4. Препаративные работы и стерилизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.4.1. Мытье посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.4.2. Приготовление сред и реактивов . . . . . . . . 84 4.4.3. Стерилизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.5. Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 4.5.1. Расходные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Стр.6
6 Оглавление 4.5.2. Холодильники и морозильники . . . . . . . . . 88 4.5.3. Контейнеры для криоконсервации . . . . . . . 88 4.5.4. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг с управляемым процессом замораживания 89 4.6. Дополнительное лабораторное оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.6.1. Компьютеры и cети . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.6.2. Прямой микроскоп . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.6.3. Низкотемпературный морозильник . . . . . . 89 4.6.4. Конфокальный микроскоп . . . . . . . . . . . . . 90 4.6.5. PCR-термоциклер (ДНК-амплификатор) . . 90 4.7. Специальное оборудование . . . . . . . . . . . 90 4.7.1. Установка для микроинъекций . . . . . . . . . . 90 4.7.2. Счетчик колоний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 4.7.3. Центрифужный элютриатор . . . . . . . . . . . . 90 4.7.4. Проточный цитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Глава 5 МЕТОДЫ АСЕПТИКИ . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.1. Цели асептики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.1.1. Риск контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.1.2. Поддержание стерильности . . . . . . . . . . . . 91 5.2. Элементы асептического окружения . . . 91 5.2.1. Ламинарный поток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.2.2. Стерильная зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 5.2.3. Рабочая поверхность . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 5.2.4. Личная гигиена . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.2.5. Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.2.6. Культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.3. Стерильные манипуляции . . . . . . . . . . . . 97 5.3.1. Протирание поверхностей . . . . . . . . . . . . . . 97 5.3.2. Закрывание емкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 5.3.3. Работа с горелкой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 5.3.4. Манипуляции с бутылями и колбами . . . . . 97 5.3.5. Пипетирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 5.3.6. Переливание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 5.4. Стандартная процедура . . . . . . . . . . . . . . 99 Протокол 5.1. Асептический метод работы в вертикальном ламинарном потоке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 Протокол 5.2. Работа на открытой поверхности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 5.5. Протокол 5.3. Работа с планшетами и чашками . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Приборы и оборудование . . . . . . . . . . . . . 104 5.5.1. Инкубаторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 5.5.2. Коробки для влажного инкубатора . . . . . . . 104 5.5.3. Культивирование в атмосфере СО2 . . . . . . . . . 104 Глава 6 БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАЛИДАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Лабораторная безопасность . . . . . . . . . . . 105 Оценка риска . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Стандартные рабочие процедуры . . . . . . 107 Контроль безопасности . . . . . . . . . . . . . . . 107 Общая безопасность . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.5.1. Оператор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 6.5.2. Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 6.5.3. Стеклянные и острые предметы . . . . . . . . . 108 6.5.4. Химическая токсичность . . . . . . . . . . . . . . . 110 6.5.5. Газы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 6.5.6. Жидкий азот . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 6.5.7. Ожоги . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 6.6. 6.7. Пожар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Ионизирующее излучение . . . . . . . . . . . . 112 6.7.1. Попадание в организм . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 6.7.2. Утилизация радиоактивных отходов . . . . . 112 6.7.3. Излучение от меченых реагентов . . . . . . . . 112 6.7.4. Излучение от высокоэнергетических источников . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Биологическая опасность . . . . . . . . . . . . . 113 6.8. 6.8.1. Уровни биологической защиты . . . . . . . . . 113 6.8.2. Ламинарные шкафы микробиологической защиты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 6.8.3. Человеческий биопсийный материал . . . . . 116 6.8.4. Манипуляции с генетическим материалом 119 6.8.5. Уничтожение биологически опасных отходов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6.8.6. Дезинфекция окуриванием . . . . . . . . . . . . . 120 6.9. Биоэтика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6.9.1. Ткани животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6.9.2. Ткани человека . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6.10. Обеспечение качества . . . . . . . . . . . . . . . . 121 6.10.1. Процедуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 6.10.2. Контроль качества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 6.11. Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 6.11.1. Подтверждение аутентичности . . . . . . . . . . 122 6.11.2. Происхождение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 6.11.3. Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Глава 7 ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . 124 Субстрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 7.1. 7.1.1. Прикрепление и рост клеток . . . . . . . . . . . . 124 7.1.2. Общепринятые материалы для субстрата . 124 7.1.3. Альтернативные субстраты . . . . . . . . . . . . . 124 7.2. Обработка поверхности . . . . . . . . . . . . . . 125 7.2.1. Покрытие матриксом . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 Протокол 7.1. Приготовление ECM . . . . . 126 7.2.2. Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 7.2.3. Неадгезивные субстраты . . . . . . . . . . . . . . . 126 7.3. Выбор культуральных сосудов . . . . . . . . 127 7.3.1. Клеточный выход . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 7.3.2. Суспензионная культура . . . . . . . . . . . . . . . 129 7.3.3. Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 7.3.4. Отбор и анализ проб . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 7.3.5. Неравномерный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 7.3.6. Расходы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 7.4. Специализированные системы . . . . . . . . 133 7.4.1. Проницаемые подложки . . . . . . . . . . . . . . . 133 7.4.2. Трехмерные матриксы . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 Глава 8 СРЕДЫ И ДОБАВКИ . . . . . . . . . . . . . . . . 135 8.1. 8.2. Составление сред . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 Физико-химические свойства . . . . . . . . . 135 8.2.1. Значение pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Стр.7
Оглавление 7 Протокол 8.1. Приготовление стандартных буферных растворов . . . . . . . . . . . 135 8.2.2. CO2 и бикарбонат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 8.2.3. Буферная система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 8.2.4. Кислород . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 8.2.5. Осмотическое давление . . . . . . . . . . . . . . . . 138 8.2.6. Температура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 8.2.7. Вязкость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 8.2.8. Поверхностное натяжение и пенообразование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 Сбалансированные солевые растворы . 142 Полная среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 8.3. 8.4. 8.4.1. Аминокислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 8.4.2. Витамины . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 8.4.3. Соли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 8.4.4. Глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 8.4.5. Органические добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 8.4.6. Гормоны и факторы роста . . . . . . . . . . . . . . 144 8.4.7. Антибиотики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 8.5. Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 8.5.1. Белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 8.5.2. Факторы роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 8.5.3. Гормоны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 8.5.4. Питательные вещества и метаболиты . . . . 146 8.5.5. Липиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 8.5.6. Неорганические вещества . . . . . . . . . . . . . . 146 8.5.7. Ингибиторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 8.6. Выбор среды и сыворотки . . . . . . . . . . . . 146 8.6.1. Резервирование партии сыворотки . . . . . . 147 8.6.2. Тестирование сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 148 8.6.3. Термическая инактивация . . . . . . . . . . . . . . 149 8.7. Другие добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 8.7.1. Гидролизаты аминокислот . . . . . . . . . . . . . 149 8.7.2. Эмбриональный экстракт . . . . . . . . . . . . . . 149 8.7.3. Кондиционированная среда . . . . . . . . . . . . 149 Глава 9 БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ . . . . . . . 150 9.1. 9.2. Недостатки сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 150 Преимущества бессывороточных сред . 154 9.2.1. Определение стандартной среды . . . . . . . . 154 9.2.2. Селективные среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 9.2.3. Регуляция пролиферации и дифференцировки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Недостатки бессывороточных сред . . . . 156 Замена сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 9.3. 9.4. 9.4.1. Коммерчески доступные бессывороточные среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 9.4.2. Заменители сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . . 156 9.4.3. Бессывороточная субкультура . . . . . . . . . . 157 9.4.4. Гормоны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 9.4.5. Факторы роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 9.4.6. Питательные вещества сыворотки . . . . . . . 158 9.4.7. Белки и полиамины . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 9.4.8. Вязкость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 9.5. Выбор бессывороточной среды . . . . . . . . 158 9.5.1. Специфичность клеток или продукта . . . . 158 9.5.2. Адаптация клеток к бессывороточной среде . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 9.6. 9.7. 9.8. 9.9. Разработка бессывороточной среды . . . . 165 Приготовление бессывороточной среды 165 Среда, не содержащая животных белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 Глава 10 ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 10.1. 10.2. 10.3. Приготовление реактивов и материалов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 Стерилизация оборудования и жидкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 10.3.1. Стеклянная посуда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Протокол 10.1. Подготовка и стерилизация изделий из стекла . . . . . . . . . . . . . . 169 10.3.2. Стеклянные пипетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 Протокол 10.2. Подготовка и стерилизация стеклянных пипеток . . . . . . . . . . . . 173 10.3.3. Завинчивающиеся крышки . . . . . . . . . . . . . 175 Протокол 10.3. Подготовка и стерилизация завинчивающихся крышек . . . . . . . . 175 10.3.4. Выбор детергента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 10.3.5. Прочее оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 10.3.6. Стерилизационные фильтры многократного использования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Протокол 10.4. Стерилизация комплекта фильтров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 10.4. 10.4.1. Вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 Протокол 10.5. Приготовление и стерилизация сверхчистой воды (UPW) . . . . . . 179 10.4.2. Техническое обслуживание водоочистительной установки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 10.4.3. Сбалансированный солевой раствор (BSS) 180 Протокол 10.6. Приготовление и стерилизация D-PBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 10.4.4. Приготовление и стерилизация среды . . . . 181 Протокол 10.7. Приготовление из концентрата с кратностью 1× . . . 182 Протокол 10.8. Приготовление среды среды из концентрата с кратностью 10× . . 182 среды из порошка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 10.4.6. Специализированная среда . . . . . . . . . . . . . 184 Протокол 10.10. Приготовление специализированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Стерилизация среды . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 10.5. 10.5.1. Автоклавируемые среды . . . . . . . . . . . . . . . 185 10.5.2. Стерилизация методом фильтрации . . . . . . 185 Протокол 10.11. Стерилизация с использованием фильтрующих насадок на шприцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 Протокол 10.12. Стерилизация с использованием фильтрующей вакуумной насадки на колбу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 10.4.5. Порошкообразные среды . . . . . . . . . . . . . . . 184 Протокол 10.9. Приготовление
Стр.8
8 Оглавление Протокол 10.13. Стерилизация с использованием малого встроенного фильтра . 189 Протокол 10.14. Стерилизационная фильтрация с использованием большого прямоточного фильтра . . . . . . . . . . . . . . . . 190 10.5.3. Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 Протокол 10.15. Сбор и стерилизация сывороток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 Протокол 10.16. Диализ сывороток . . . . . 194 10.5.4. Приготовление и стерилизация других реагентов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 10.6. Контроль, проверка качества и хранение сред . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 10.6.1. Контроль качества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 10.6.2. Проверка стерильности . . . . . . . . . . . . . . . . 196 10.6.3. Проверка культуральных свойств . . . . . . . . 197 10.6.4. Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 Глава 11 ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . . . 199 11.1. Инициация первичной культуры клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 11.1.1. Ферменты, используемые для дезагрегации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 11.1.2. Общие характеристики дезагрегации . . . . 199 11.2. Выделение образцов ткани . . . . . . . . . . . . 200 11.2.1. Мышиный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 Протокол 11.1. Выделение мышиного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 11.2.2. Куриный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Протокол 11.2. Выделение куриного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 11.2.3. Биопсийный материал человека . . . . . . . . . 204 Протокол 11.3. Передача и получение биопсийного материала человека . . . . . . . 206 Типы первичной культуры . . . . . . . . . . . 206 11.3. 11.3.1. Первичный эксплантат . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Протокол 11.4. Первичные эксплантаты . 206 11.3.2. Ферментативная дезагрегация . . . . . . . . . . 208 11.3.3. Теплый трипсин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Протокол 11.5. Дезагрегация ткани теплым трипсином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 11.3.4. Трипсинизация с преинкубацией на холоде . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 Протокол 11.6. Дезагрегация ткани в холодном трипсине . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 11.3.5. Рудиментарные органы куриного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Протокол 11.7. Рудиментарные органы куриного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 11.3.6. Дезагрегация с использованием других ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 11.3.7. Коллагеназа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 Протокол 11.8. Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы . . . . . . . . . . . . . . . . 215 11.3.8. Механическая дезагрегация . . . . . . . . . . . . 219 Протокол 11.9. Механическая дезагрегация ткани путем просеивания . . . . . . . 220 12.4. 11.3.9. Разделение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 Протокол 11.10. Обогащение доли жизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 11.3.10. Первичная культура, краткие выводы . . . . 222 11.3.11. Первичная документация . . . . . . . . . . . . . . 222 Глава 12 СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 12.1. 12.1.1. Перекрестная контаминация и неправильная идентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 12.1.2. Микоплазменная контаминация . . . . . . . . . 227 12.1.3. Терминология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 12.1.4. Маркировка клеточной культуры . . . . . . . . 228 12.1.5. Возраст культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 12.2. 12.3. Выбор клеточной линии . . . . . . . . . . . . . . 229 Обычный порядок поддержания культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 12.3.1. Значение клеточной морфологии . . . . . . . . 230 12.3.2. Замена среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 12.3.3. Стандартный протокол замены среды . . . . 232 Протокол 12.1. Питание культуры во флаконах . . . . . . . . . . . . . . 232 Протокол 12.2. Питание монослойной монослойной культуры в чашках и планшетах . . . . . 233 Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 12.4.1. Критерии субкультивирования . . . . . . . . . . 234 12.4.2. Стандартный протокол субкультивирования клеток, образующих монослой . . . . . . . . . . 236 Протокол 12.3. Субкультивирование клеток, образующих монослой . . . . . . . . . . 236 12.4.3. Цикл роста и индекс разведения . . . . . . . . 238 12.4.4. Концентрация клеток в субкультуре . . . . . 239 12.4.5. Размножение в суспензии . . . . . . . . . . . . . . 239 12.4.6. Субкультивирование клеток, растущих в суспензии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 Протокол 12.4. Суспензионное субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 12.4.7. Стандартизация условий культивирования 241 12.4.8. Использование антибиотиков . . . . . . . . . . . 242 12.4.9. Ведение документации . . . . . . . . . . . . . . . . 242 Глава 13 КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ . . . . . 244 13.1. 13.2. Клонирование клеток . . . . . . . . . . . . . . . . 244 Протокол 13.1. Клонирование с разведением . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 Стимуляция эффективности посева . . . 247 13.2.1. Условия, которые улучшают клональный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 13.2.2. Кондиционированные среды . . . . . . . . . . . . 249 Протокол 13.2. Приготовление кондиционированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 13.2.3. Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250 Протокол 13.3. Приготовление фидерных слоев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250 Суспензионное клонирование . . . . . . . . . 251 13.3.
Стр.9
Оглавление 9 Протокол 13.4. Клонирование в агаре . . . . 251 Протокол 13.5. Клонирование в Methocel . 252 13.4. Выделение клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 Протокол 13.6. Выделение клонов с использованием колец для клонирования . . . . . 255 Протокол 13.7. Выделение клеточных колоний путем облучения . . . . . . . . . . . . . 257 13.4.1. Другие методы выделения монослойных клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 13.4.2. Суспензионные клоны . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 Протокол 13.8. Выделение суспензион13.5. 13.6. 13.7. 13.8. ных клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 Получение репликативных колоний . . . 258 Селективные ингибиторы . . . . . . . . . . . . 259 Выделение генетических вариантов . . . 259 Протокол 13.9. Метотрексат-резистентность и DHFR-амплификация . . . . . . . . 259 Взаимодействие с субстратом . . . . . . . . . 261 13.8.1. Селективная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 13.8.2. Селективное открепление . . . . . . . . . . . . . . 261 13.8.3. Природа субстрата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 13.8.4. Селективные фидерные слои . . . . . . . . . . . 261 13.8.5. Селекция на полужидкой среде . . . . . . . . . 261 Глава 14 РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . 263 14.1. Плотность клеток и изопикническая седиментация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Протокол 14.1. Разделение клеток центрифугированием в градиенте плотности 263 14.2. Размер клеток и скорость седиментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 14.2.1. Гравитационная седиментация . . . . . . . . . . 266 14.2.2. Элютриация центрифугированием . . . . . . . 266 14.3. Методы, основанные на применении антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 14.3.1. Иммунный пэннинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 14.3.2. Магнитный сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 Протокол 14.2. Магнитно-активированный клеточный сортинг (MACS) . . . . . . . . . 269 14.4. Флуоресцентно-активируемый клеточный сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 Другие методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 14.5. 14.6. Подходы для начинающих к освоению клеточного сортинга . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 Глава 15 ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК . . . . . . . . 274 15.1. 15.2. 15.3. Необходимость характеристики . . . . . . . 274 Аутентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 15.4. Ведение документации и происхождение клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 Параметры характеристики . . . . . . . . . . 275 15.4.1. Видовая идентификация . . . . . . . . . . . . . . . 275 15.4.2. Происхождение тканевых маркеров . . . . . . 276 15.4.3. Уникальные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 15.4.4. Трансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 15.5. Морфология клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 15.5.1. Микроскопия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 Протокол 15.1. Использование инвертированного микроскопа . . . . . . . . . . . . . . . . 284 15.5.2. Окрашивание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 Протокол 15.2. Окрашивание по Гимзе . . . 285 Протокол 15.3. Окрашивание кристаллвиолетом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 15.5.3. Культуральные сосуды для цитологии: монослойные культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 15.5.4. Приготовление суспензионной культуры для цитологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 Протокол 15.4. Подготовка суспензионной культуры клеток для цитологических исследований методом цитоцентрифугирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Протокол 15.5. Фильтрационная цитология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 15.5.5. Микрофотография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 Протокол 15.6. Цифровая фотография на микроскопе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Конфокальная микроскопия . . . . . . . . . . 289 15.6. 15.7. Хромосомный состав . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 Протокол 15.7. Приготовление хромосомного препарата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 15.7.1. Дифференциальное окрашивание хромосом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 15.7.2. Хромосомный анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 15.8. Анализ ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 15.8.1. Гибридизация ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 15.8.2. Фингерпринтинг ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 15.8.3. Анализ профиля ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 Протокол 15.8. Анализ STR-профиля ДНК клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 Рнк и экспрессия белка . . . . . . . . . . . . . . . 298 Активность ферментов . . . . . . . . . . . . . . . 298 15.9. 15.10. 15.10.1. Изоферменты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298 15.10.2. Изоферментный электрофорез с набором для определения аутентичности Authentikit . . . 300 Протокол 15.9. Изоферментный анализ . . 300 Антигенные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . 303 15.11. 15.11.1. Иммунное окрашивание . . . . . . . . . . . . . . . 304 Протокол 15.10. Непрямая иммунофлуоресценция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 15.11.2. Иммунный анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305 15.12. Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Глава 16 ДИФФЕРЕНЦИРОВКА . . . . . . . . . . . . . . . 307 16.1. Экспрессия фенотипа in vivo . . . . . . . . . . 307 16.1.1. Дедифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307 16.1.2. Линейная селекция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307 16.2. 16.3. 16.4. Стадии дифференцировки . . . . . . . . . . . . 307 Пролиферация и дифференцировка . . . . 308 16.5. 16.6. 16.7. Коммитирование и линии дифференцировки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 Пластичность стволовых клеток . . . . . . 309 Маркеры дифференцировки . . . . . . . . . . 310 Индукция дифференцировки . . . . . . . . . . 311 16.7.1. Межклеточные взаимодействия . . . . . . . . . 311
Стр.10
10 Оглавление 16.7.2. Системные факторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 16.7.3. Взаимодействия клетки с матриксом . . . . . 315 16.7.4. Полярность и форма клетки . . . . . . . . . . . . 316 16.7.5. Давление кислорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316 16.8. 16.9. Дифференцировка и злокачественность 317 Практические аспекты . . . . . . . . . . . . . . . 317 Глава 17 ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 17.1. 17.2. 17.3. Роль в характеристике клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 Что такое трансформация? . . . . . . . . . . . 318 Генетическая нестабильность и гетерогенность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 17.3.1. Генетическая нестабильность . . . . . . . . . . . 318 17.3.2. Хромосомные аберрации . . . . . . . . . . . . . . . 320 17.4. Иммортализация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321 17.4.1. Контроль физиологического старения . . . . 322 17.4.2. Иммортализация с использованием вирусных генов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322 17.4.3. Иммортализация человеческих фибробластов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 Протокол 17.1. Иммортализация фибробластов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 17.4.4. Теломеразоиндуцированная иммортализация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326 Протокол 17.2. Иммортализация мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью теломеразы . . . . . . . . . . . . . 327 17.4.5. Иммортализация лимфоцитов . . . . . . . . . . 329 17.4.6. Трансгенные мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329 17.5. Аберрантный контроль роста . . . . . . . . . 329 17.5.1. Независимость от прикрепления к субстрату . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329 17.5.2. Контактное ингибирование . . . . . . . . . . . . . 330 Протокол 17.3. Ограничение клеточной пролиферации плотностью суспензии . 330 17.5.3. Зависимость от сыворотки . . . . . . . . . . . . . 331 17.5.4. Онкогены . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332 17.6. Туморогенность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332 17.6.1. Малигнизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332 17.6.2. Опухолевая трансплантация . . . . . . . . . . . . 333 17.6.3. Инвазивность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333 17.6.4. Ангиогенез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 Протокол 17.4. Исследование ангиогенеза in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335 17.6.5. Активатор плазминогена . . . . . . . . . . . . . . . 337 Глава 18 КОНТАМИНАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 18.1. Источники контаминации . . . . . . . . . . . . 338 18.1.1. Техника работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 18.1.2. Окружающая среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 18.1.3. Использование и обслуживание ламинарного шкафа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 18.1.4. Инкубаторы с увлажнением . . . . . . . . . . . . 341 Протокол 18.1. Обработка инкубаторов . 341 18.1.5. Холодильные камеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 18.1.6. Стерильные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . 342 18.1.7. Доставленные клеточные линии и образцы биопсии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 18.1.8. Карантин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 18.2. 18.3. Виды микробной контаминации . . . . . . 342 Контроль контаминации . . . . . . . . . . . . . 342 18.3.1. Визуально определяемая микробная контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 18.3.2. Микоплазмы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 18.3.3. Флуоресцентное окрашивание микоплазм 345 Протокол 18.2. Выявление микоплазм методом флуоресценции . . . . . . . . . . . . . . 345 18.3.4. Использование PCR для обнаружения микоплазм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 Протокол 18.3. Использование PCR для обнаружения микоплазм . . . . . . . . . . . . . . 346 18.3.5. Альтернативные методы детекции микоплазм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348 18.3.6. Сервисные службы по обнаружению микоплазм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 18.3.7. Вирусная контаминация . . . . . . . . . . . . . . . 350 18.4. 18.5. Уничтожение контаминированных культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 Устранение контаминации . . . . . . . . . . . . 350 18.5.1. Бактерии, грибы и дрожжи . . . . . . . . . . . . . 350 Протокол 18.4. Устранение микробной контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 18.5.2. Устранение микоплазм . . . . . . . . . . . . . . . . 351 Протокол 18.5. Устранение микоплазменной контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 18.5.3. Устранение вирусной контаминации . . . . . 352 18.5.4. Персистирующая контаминация . . . . . . . . 352 18.6. 18.7. Перекрестная контаминация . . . . . . . . . 354 Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 Глава 19 КРИОКОНСЕРВАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . 355 19.1. 19.2. Предпосылки метода замораживания . . 355 Подготовка к криоконсервации . . . . . . . 355 19.2.1. Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356 19.2.2. Когда нужно замораживать . . . . . . . . . . . . . 356 19.3. Принципы криоконсервации . . . . . . . . . 356 19.3.1. Теоретическое обоснование замораживания клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356 19.3.2. Концентрация клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356 19.3.3. Среда для замораживания . . . . . . . . . . . . . . 356 19.3.4. Скорость охлаждения . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 19.3.5. Ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 19.3.6. Криоморозильники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 19.3.7. Замораживание культивируемых клеток . . 362 Протокол 19.1. Замораживание клеток . . 362 19.3.8. Протоколирование работы морозильника . 364 19.3.9. Размораживание хранившихся ампул . . . . 364 Протокол 19.2. Размораживание клеток . 364 19.3.10. Флаконы для замораживания . . . . . . . . . . . 367 19.4. Витрификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 19.4.1. Криоконсервация эмбриональных стволовых клеток человека (hES) . . . . . . . . . . . . . 367 Протокол 19.3. Криоконсервация hESклеток путем витрификации . . . . . . . . 367
Стр.11
Оглавление 11 19.4.2. Размораживание hES-клеток . . . . . . . . . . . . 368 Протокол 19.4. Размораживание hESклеток, криоконсервированных путем витрификации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368 19.5. Дизайн и контроль замороженных запасов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369 19.5.1. Инвентарный контроль морозильника . . . . 369 19.5.2. Периодическая замена запасов культур . . . 370 19.6. 19.7. Банки клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370 Транспортировка клеточных культур . . 371 19.7.1. Замороженные ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . 371 19.7.2. Живые культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 Глава 20 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ . . . . . . . 373 20.1. Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373 20.1.1. Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374 Протокол 20.1. Подсчет клеток при помощи гемоцитометра . . . . . . . . . . . . . . 374 20.1.2. Электронный счетчик . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 Протокол 20.2. Электронный подсчет клеток на основе электрического сопротивления . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378 20.1.3. Окрашенные монослои . . . . . . . . . . . . . . . . 380 20.1.4. Проточная цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . 380 20.2. 20.3. Вес клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381 20.4. Содержание ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Протокол 20.3. Оценка содержания ДНК с использованием красителя Hoechst 33258 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Белок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 20.4.1. Солюбилизация образца . . . . . . . . . . . . . . . 382 20.4.2. Метод исследования белка по Брэдфорду . 382 Протокол 20.4. Оценка содержания белка методом Брэдфорда . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Скорость синтеза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384 20.5. 20.5.1. Синтез ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384 Протокол 20.5. Оценка уровня синтеза ДНК методом включения [3Н]-тимидиновой метки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384 20.5.2. Синтез белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Протокол 20.6. Синтез белка . . . . . . . . . . . 385 20.6. 20.7. Приготовление образцов для ферментного и иммуноферментного анализа . . . 386 Цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386 20.7.1. Мечение in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386 20.7.2. Проточная цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . 386 20.8. Репликация образцов . . . . . . . . . . . . . . . . 386 20.8.1. Сбор данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 20.8.2. Анализ данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 20.9. Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 387 20.9.1. Разработка эксперимента . . . . . . . . . . . . . . 387 20.9.2. Цикл роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 Протокол 20.7. Кривая роста монослоя во флаконах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391 Протокол 20.8. Кривая роста монослоя в многолуночном планшете . . . . . . . . . . 391 20.9.3. Анализ кривых роста монослоя . . . . . . . . . 392 20.9.4. Объем среды, концентрация и плотность клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393 20.9.5. Суспензионные культуры . . . . . . . . . . . . . . 394 Протокол 20.9. Кривая роста суспензионной культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394 20.9.6. Фазы цикла роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394 20.9.7. Производные кривой роста . . . . . . . . . . . . . 395 20.10. Эффективность культивирования . . . . . 396 Протокол 20.10. Определение эффективности посева на чашки Петри . . . . . . . 397 20.10.1. Анализ формирования колоний . . . . . . . . . 399 20.10.2. Автоматический счетчик колоний . . . . . 399 20.11. Индекс мечения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399 Протокол 20.11. Индекс мечения [3Н]-тими ди ном . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 20.11.1. Ростовая фракция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401 Протокол 20.12. Определение фракции пролиферирующих клеток . . . . . . . . . . . . . . 401 20.11.2. Митотический индекс . . . . . . . . . . . . . . . . . 401 20.11.3. Индекс пролиферации . . . . . . . . . . . . . . . . 401 20.12. Время клеточного цикла . . . . . . . . . . . . . 402 20.13. Миграция клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402 Глава 21 ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ . . . . . . . . . . . . . . . 403 21.1. 21.2. Жизнеспособность, токсичность и выживаемость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403 Ограничения in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . 404 21.2.1. Фармакокинетика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404 21.2.2. Метаболизм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404 21.2.3. Тканевой и системный ответы . . . . . . . . . . 404 21.3. Характер исследований . . . . . . . . . . . . . . 404 21.3.1. Жизнеспособность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 Протокол 21.1. Оценка жизнеспособности методом отторжения красителя . . . . 405 Протокол 21.2. Оценка жизнеспособности методом поглощения красителя . . . . . 405 21.3.2. Выживаемость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406 Протокол 21.3. Клоногенный анализ прикрепленных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 406 21.3.3. Анализ, основанный на клеточной пролиферации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410 21.3.4. Метаболический анализ цитотоксичности 410 21.3.5. Микротитрационный анализ . . . . . . . . . . . . 410 Протокол 21.4. Оценка цитотоксичности при помощи МТТ-теста . . . . . . . . . . . . 411 21.3.6. Сравнительная оценка микротитрационного и клоногенного анализа выживания . . . . . . 414 21.3.7. Взаимодействие лекарственных препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 21.4. Применение исследования цитотоксичности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415 22.4.1. Скрининг противораковых препаратов . . . 415 21.4.2. Прогностические исследования противоопухолевых препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . 415 21.4.3. Фармацевтическое тестирование . . . . . . . . 416 21.5. Генотоксичность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Стр.12
12 Оглавление 21.5.1. Анализ мутагенеза методом обмена сестринских хроматид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 Протокол 21.5. Обмен сестринских хроматид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 21.5.2. Канцерогенность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418 21.6. Воспаление . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 Глава 22 КУЛЬТУРЫ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 22.1. 22.2. Клеточные культуры специализированных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420 Эпителиальные клетки . . . . . . . . . . . . . . 422 22.2.1. Эпидермис . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423 Протокол 22.1. Эпидермальные кератиноциты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424 22.2.2. Роговица . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427 Протокол 22.2. Эпителиальные клетки роговицы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427 22.2.3. Молочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429 Протокол 22.3. Получение эпителиальных клеток молочной железы из тканей, отобранных при маммопластике . . . . . 429 22.2.4. Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431 Протокол 22.4. Цервикальный эпителий . 431 22.2.5. Желудочно-кишечный тракт . . . . . . . . . . . . 433 Протокол 22.5. Выделение и культивирование клеток крипт толстого кишечника . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433 22.2.6. Печень . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434 22.2.7. Первичная культура гепатоцитов . . . . . . . . 434 Протокол 22.6 А. Выделение гепатоцитов крысы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435 22.2.8. Гепатоциты человека HepaRG . . . . . . . . . . 436 Протокол 22.6 Б. Очистка гепатоцитов человека HepaRG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 22.2.9. Поджелудочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . 438 Протокол 22.7. Эпителий поджелудочной железы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438 22.2.10. Почка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439 Протокол 22.8. Эпителий почки . . . . . . . . 440 22.2.11. Бронхиальный и трахеальный эпителий . . 441 Протокол 22.9. Бронхиальный и трахеальный эпителий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441 22.2.12. Эпителий ротовой полости . . . . . . . . . . . . . 442 Протокол 22.10. Кератиноциты ротовой полости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442 22.2.13. Простата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443 Протокол 22.11. Эпителий простаты . . . 444 22.3. Мезенхимальные клетки . . . . . . . . . . . . . 445 22.3.1. Соединительная ткань . . . . . . . . . . . . . . . . . 445 22.3.2. Жировая ткань . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445 Протокол 22.12. Первичная культура адипоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446 22.3.3. Мышцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447 Протокол 22.13. Выделение и культивирование гладкомышечных клеток . . . . . . . 447 Протокол 22.14. Культура миобластов взрослой скелетной мышцы . . . . . . . . . 448 Протокол 22.15. Культура отдельного мышечного волокна скелетной мышцы 450 22.3.4. Хрящи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 Протокол 22.16. Хондроциты на альгинатных бусинах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 22.3.5. Кости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453 Протокол 22.17. Остеобласты . . . . . . . . . 454 22.3.6. Эндотелий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455 Протокол 22.18. Выделение и культивирование клеток сосудистого эндотелия . 455 Нейроэктодермальные клетки . . . . . . . . 459 22.4. 22.4.1. Нейроны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459 Протокол 22.19. Выделение и культивирование тучных клеток мозжечка . . . . . . 459 22.4.2. Глиальные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 460 Протокол 22.20. Первичная культура астроцитов человека . . . . . . . . . . . . . . . 461 Протокол 22.21. Обонятельные клетки . . 463 22.4.3. Эндокринные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 22.4.4. Меланоциты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 Протокол 22.22. Культура меланоцитов . 466 Гематопоэтические клетки . . . . . . . . . . . . 467 Гонады . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 22.5. 22.6. 22.6.1. Яичники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 22.6.2. Тестикулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 Глава 23 СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ГАМЕТЫ И АМНИОЦИТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 Стволовые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 23.1. 23.1.1. Эмбриональные стволовые клетки . . . . . . . 470 23.1.2. Происхождение эмбриональных стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 Протокол 23.1. Получение и первичное культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . 471 23.1.3. Субкультура и размножение эмбриональных стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . 474 Протокол 23.2. Размножение эмбриональных стволовых клеточных линий мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474 23.1.4. Первичная культура эмбриональных стволовых клеток человека . . . . . . . . . . . . . . . . 476 Протокол 23.3. Получение эмбриональных стволовых клеток человека . . . . . . . . . . 476 23.1.5. Пересадка hES-клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 477 Протокол 23.4. Пересадка hES-клеток . . . 477 23.1.6. Плюрипотентные стволовые клетки из эмбрионов рыбы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478 Протокол 23.5. Культуры клеток эмбриона данио-рерио . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479 Половые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481 Экстраэмбриональные клетки . . . . . . . . 481 23.2. 23.3. 23.3.1. Культура амниоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481 Протокол 23.6. Культура амниоцитов . . . 482 23.3.2. Неонатальные и ювенильные клетки . . . . . 485 23.3.3. Мультипотентные стволовые клетки взрослых . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 23.3.4. MSC из костного мозга человека . . . . . . . . 486
Стр.13
Оглавление 13 Протокол 23.7. Получение MSC из костного мозга человека . . . . . . . . . . . . . . . . 487 23.3.5. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488 Протокол 23.8. Перепрограммирование человеческих дермальных фибробластов для генерации плюрипотентных стволовых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489 23.3.6. Долгоживущие культуры костного мозга мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 Протокол 23.9. Долгоживущие гематопоэтические клеточные культуры из костного мозга мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 23.3.7. Долгоживущие культуры человеческих примитивных гематопоэтических клеток . . . . 493 Протокол 23.10. Исследование инициирующих долгоживущую культуру человеческих клеток (LTC-IC) . . . . . . . . . . . . . . . 493 23.3.8. Исследование гематопоэтических колониеобразующих клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 496 Протокол 23.11. Исследование гематопоэтических колониеобразующих клеток . 496 Глава 24 КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК . . 499 24.1. 24.2. Проблемы культивирования опухолевых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 499 Получение образцов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 24.2.1. Селекция репрезентативных клеток . . . . . . 500 24.2.2. Сохранение тканей замораживанием . . . . . 500 Протокол 24.1. Замораживание образцов биопсии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 Дезагрегация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501 Первичная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . 501 24.3. 24.4. 24.5. Селективная культура опухолевых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502 24.5.1. Селективные среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502 24.5.2. Конфлюэнтные фидерные слои . . . . . . . . . 502 Протокол 24.2. Рост на конфлюэнтных фидерных слоях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503 24.5.3. Суспензионное клонирование . . . . . . . . . . 505 24.5.4. Ксенотрансплантаты . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505 24.6. Размножение клеточных линий . . . . . . . 505 24.6.1. Субкультивирование первичной опухолевой культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505 24.6.2. Постоянные клеточные линии . . . . . . . . . . 506 24.7. Характеристика культур опухолевых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506 24.7.1. Гетерогенность опухолевых культур . . . . . 506 24.7.2. Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . . . 507 24.8. Специфические опухолевые культуры . 507 24.8.1. Молочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507 Протокол 24.3. Культивирование клеток опухоли молочной железы . . . . . . . . . . . 508 24.8.2. Легкое . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509 24.8.3. Желудок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509 24.8.4. Толстый кишечник . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509 Протокол 24.4. Культура колоректальных опухолей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510 24.8.5. Поджелудочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . 512 24.8.6. Яичники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512 24.8.7. Простата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 24.8.8. Мочевой пузырь . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 24.8.9. Кожа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 24.8.10. Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 24.8.11. Глиома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 24.8.12. Нейробластома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 24.8.13. Сперматоцитома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 24.8.14. Лимфома и лейкемия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 Протокол 24.5. Определение постоянных клеточных линий лейкемии и лимфомы 515 Глава 25 ТРЕХМЕРНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . 516 25.1. Межклеточное взаимодействие и фенотипическая экспрессия . . . . . . . . . . . . . . . 516 25.1.1. Роль плотности клеточной суспензии . . . . 516 25.1.2. Реципрокные взаимодействия . . . . . . . . . . 516 25.1.3. Выбор моделей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517 25.2. Органная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517 25.2.1. Обмен питательных веществ и газов . . . . . 517 25.2.2. Структурная целостность . . . . . . . . . . . . . . 519 25.2.3. Рост и дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . 519 25.2.4. Ограничения метода органной культуры . . 519 25.2.5. Типы органных культур . . . . . . . . . . . . . . . . 520 Протокол 25.1. Органная культура . . . . . . 520 Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . 521 25.3. 25.3.1. Метод геля и губки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 521 25.3.2. Полые волокна . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522 25.3.3. Сфероиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522 Протокол 25.2. 3D-культуры в сфероидах 523 25.3.4. Система вращающихся камер . . . . . . . . . . . 525 25.3.5. Иммобилизация живых клеток в альгинате . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525 25.3.6. Фильтрационные вкладыши для лунок . . . 526 Протокол 25.3. Фильтрационные вкладыши для лунок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526 25.3.7. Культуры нейрональных агрегатов . . . . . . . 528 Протокол 25.4. Нейрональные агрегаты . 528 Органотипическая культура . . . . . . . . . . 529 25.4. 25.4.1. Тканевые эквиваленты . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 25.4.2. Тканевая инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 25.5. Создание трехмерных изображений клеток (3D-реконструкций) . . . . . . . . . . . . . . 531 Глава 26 УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВА КЛЕТОК И АВТОМАТИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . 532 26.1. Увеличение производства суспензионных культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532 Протокол 26.1. Перемешивание 4-литровой партии суспензионной культуры . . . . . 533 26.1.1. Постоянная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535 26.1.2. Масштаб и сложности . . . . . . . . . . . . . . . . . 536 26.1.3. Перемешивание и аэрация . . . . . . . . . . . . . 536 26.2. Крупномасштабное производство монослойных культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539 26.2.1. Мультиповерхностные культиваторы . . . . 539
Стр.14
14 Оглавление Протокол 26.2. Система Nunc Cell Factory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539 26.2.2. Роллерные культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542 Протокол 26.3. Культура в роллерных бутылях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542 26.2.3. Микроносители . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544 Протокол 26.4. Микроносители . . . . . . . . . 544 26.2.4. Крупные микроносители . . . . . . . . . . . . . . . 546 26.2.5. Перфузионные монослойные культуры . . . 546 26.3. 26.4. Управление процессом . . . . . . . . . . . . . . . 547 Автоматизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549 26.4.1. Роботизированная система культуры клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 550 26.4.2. Высокопроизводительный скрининг . . . . . 550 Глава 27 СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ . . . . . . . . . . 551 27.1. Методы подготовки и исследования лимфоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551 27.1.1. Выделение по плотности . . . . . . . . . . . . . . . 551 Протокол 27.1. Подготовка препарата лимфоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551 27.1.2. Бласттрансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552 Протокол 27.2. РНА-стимуляция лимфоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552 27.2. 27.3. 27.4. Авторадиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552 Протокол 27.3. Микроавторадиография . 554 Съемка в режиме замедленного времени . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 557 Протокол 27.4. Видеосъемка в режиме замедленного времени . . . . . . . . . . . . . . . . 557 Синхронизация клеток . . . . . . . . . . . . . . . 559 27.4.1. Разделение клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559 27.4.2. Блокирование пролиферации . . . . . . . . . . . 559 27.5. Культуры клеток пойкилотермных животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559 27.5.1. Клетки рыб . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560 27.5.2. Клетки насекомых . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560 Протокол 27.5. Культивирование клеток насекомых . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560 27.6. СЛИЯНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561 27.6.1. Клеточная гибридизация . . . . . . . . . . . . . . . 561 Протокол 27.6. Клеточная гибридизация . 561 27.6.2. Ядерный перенос . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563 27.7. Продукция моноклональных антител . . 563 Протокол 27.7. Продукция моноклональных антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564 Глава 28 ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ . . . . 567 28.1. 28.2. Цели и задачи главы . . . . . . . . . . . . . . . . . 567 Навыки препаративных работ и обращения с оборудованием . . . . . . . . . . . . . . . . . 567 Упражнение 1. Стерильное пипетирование и перенос жидкостей . . . . . . . . . . . . . . . 569 Упражнение 2. Мытье и стерилизация стеклянной посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 571 Упражнение 3. Приготовление и стерилизация воды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572 28.5. 28.3. Упражнение 4. Приготовление и стерилизация фосфатного буферного раствора Дульбекко (D-PBS) без Ca2+ и Mg2+ (D-PBSА) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573 Упражнение 5. Приготовление стандартных рН-растворов . . . . . . . . . . . . . . . . . 574 Упражнение 6. Приготовление основной питательной среды из порошка и стерилизация методом фильтрования . . . 575 Основные методы работы с культурой клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577 Упражнение 7. Наблюдение за культурой клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577 Упражнение 8. Приготовление стерильной питательной среды . . . . . . . . . . . . . . . . 579 Упражнение 9. Смена среды в монослойной культуре . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580 Упражнение 10. Приготовление полной среды из концентрата 10× . . . . . . . . . . 582 Упражнение 11. Подсчет клеток с помощью гемоцитометра и электронного счетчика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584 Упражнение 12. Субкультивирование клеток, растущих в суспензии . . . . . . . . . . 587 Упражнение 13. Субкультивирование клеточных линий, растущих в монослое . . 589 Упражнение 14. Окрашивание монослойной клеточной культуры по Гимзе . . . . 591 Упражнение 15. Построение и анализ кривой роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592 28.4. Упражнения повышенной сложности . . 595 Упражнение 16. Характеристика клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595 Упражнение 17. Обнаружение микоплазм 596 Упражнение 18. Криоконсервация культивируемых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 597 Упражнение 19. Первичная культура . . . . 600 Упражнение 20. Клонирование клеток, растущих в монослое . . . . . . . . . . . . . . . 604 Специализированные упражнения . . . . 606 Глава 29 РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ . . . . . . . . . . . . . . . 607 29.1. Аномальный внешний вид клеток . . . . . 607 29.2. Медленный рост клеток . . . . . . . . . . . . . . 608 29.2.1. Проблемы, ограниченные вашими собственными культурами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608 29.2.2. Более общие проблемы. Проблемы, с которыми столкнулись другие исследователи . 608 Среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 610 29.3. 29.3.1. Состав, приготовление и хранение . . . . . . . 610 29.3.2. Нестабильные реагенты . . . . . . . . . . . . . . . 612 29.3.3. Чистота компонентов среды . . . . . . . . . . . . 612 29.4. 29.5. Субстраты и контейнеры . . . . . . . . . . . . . 613 Микробиологическая контаминация . . 614 29.5.1. Контаминация, ограниченная одним исследователем . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614 29.5.2. Широко распространенная контаминация 616
Стр.15
Оглавление 15 29.5.3. Системы подачи воздуха и ламинарные боксы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618 29.5.4. Специфическая контаминация . . . . . . . . . . 618 29.6. Химическое загрязнение . . . . . . . . . . . . . . 619 29.6.1. Стекло . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619 29.6.2. Пипетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619 29.6.3. Система очистки воды . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 29.6.4. Криоконсерванты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 29.6.5. Порошки и аэрозоли . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 29.7. Первичная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 29.7.1. Недостаточное количество взятых клеток в первичной культуре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 29.7.2. Неправильная селекция клеток . . . . . . . . . . 622 29.7.3. Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622 29.8. 29.9. Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622 Питание культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623 29.9.1. Простые монослойные культуры . . . . . . . . 623 29.9.2. Клонирование клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623 29.10. Субкультура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624 29.10.1. Недостаточное количество взятых клеток или медленный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624 29.10.2. Неравномерное развитие культуры . . . . . . 624 29.11. Клонирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625 29.11.1. Слишком мало колоний в чашке . . . . . . . . . 625 29.11.2. Слишком много колоний в чашке . . . . . . . . 626 29.11.3. Неравномерное распределение . . . . . . . . . . 627 29.12. Перекрестная контаминация и неверная идентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627 29.13. Криоконсервация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 628 29.13.1. Плохое восстановление . . . . . . . . . . . . . . . . 628 Приложение I РАСЧЕТЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632 Приложение II ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 640 Приложение III КОМПАНИИ-ПОСТАВЩИКИ И ДРУГИЕ РЕСУРСЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 664 Приложение IV СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ [по Schaeff er, 1990] 677 Приложение V КОНТАМИНИРОВАННЫЕ ИЛИ НЕПРАВИЛЬНО ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ . . . . . . . . . . . . . . . 684 Приложение VI ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . 707 Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 709 Предметный указатель . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 758 29.13.2. Измененный внешний вид после криоконсервации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 629 29.13.3. Потеря ростовой культуры . . . . . . . . . . . . . 629 29.14. Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630 29.14.1. Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630 29.14.2. Электронный счетчик с измерением сопротивления в капилляре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630 Глава 30 ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 631
Стр.16

Облако ключевых слов *


* - вычисляется автоматически