В монографии наряду с описанием метаболизма гомоцистеина, «редокс-статуса» тиолов, вопросов подготовки и хранения проб представлен материал по количественному определению гомоцистеина и других аминотиолов. <...> ISBN 978-5-02-039214-4 © Кубатиев А.А., Иванов А.В., Лузянин Б.П., 2016 © ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, 2016 © ФГУП Издательство «Наука», 2016 CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2MEA 2-меркаптоэтиламин 2MC 2-метилцистеин 4-MSA 4-малеимидилсалициловая кислота ANM анилиннафтилмалеимид ARM анилинфенилмалеимид ABD-F 4-аминосульфонил-7-фтор-2,1,3-бензоксидиазол AcABD-F 4-(N-ацетиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3бензоксидиазол BIPM N-[4-(2-бензимидазолил)фенил]-малеимид bHcy связанный гомоцистеин CMQTB 2-хлоро-1-метилхинолинтетрафторборат CMPI 2-хлор-1-метилпиридин иодид CSF спинномозговая жидкость Cys цистеин Cysta цистатионин Cys-Gly цистеинилглицин CV DTTI дитиотреитол DTE дитиоэритриол DTDNA DTNBA коэффициент вариации 6,6’-дитиодиникотиновая кислота 5,5’-дитио-бис(2-нитробензойная кислота) DMANSC 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид DAM диметиламинофенилмалеимид dPA d-пеницилламин DBPM N-[4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил] малеимид DTDP DBD-F 4,4’-дитиодипиридин DACM N-(7-диметиламино-4-метил-2-оксо-3-хрометил) малеимид 4’-(N,N-диметиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3бензоксидиазол EDTA калиевая/натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 3 EOF электро-осмотический поток (ЭОП) FITC флуоресцеинизотиоцианат FM флуоресцеин-5-малеимид FPIA GC флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ газовая хроматография (ГХ) GITC 2,3,4,6-тетра-О-ацето-β-D-глюкопиранозил изотиоцианат GSH глутатион Glu-Cys глутамилцистеин Hcy гомоцистеин ITC изотиоцианат IAF иодоацетаминофлуоресцеин МАТ метионинаденозинтрансфераза MCE меркаптоэтанол MeCys метилцистеин МEKC мицеллярный капиллярный электрофорез Met метионин mBrB монобромбиман mBrTMAB монобромтриметиламинобиман MPA 3-меркаптопропионовая кислота MPG N-(2-меркаптопропионил)глицин MS метионинсинтаза МТ метилтрансфераза MTBSTFA N-метил-N-(трет-бутил-диметилсилил)трифторацетамид MTHFR <...>
Аналитические_методы_исследования_гомоцистеина.pdf
УДК 616
ББК 28.707
K88
Рецензенты:
член-корреспондент РАН В.С. РЕПИН
академик РАН В.А. ЮРКИВ
Кубатиев А.А., Иванов А.В., Лузянин Б.П.
Аналитические методы исследования гомоцистеина / ФГБНУ НИИ
общей патологии и патофизиологии М. : Наука, 2016. – 172 с. – ISBN
978-5-02-039214-4.
В монографии наряду с описанием метаболизма гомоцистеина, «редокс-статуса»
тиолов, вопросов подготовки и хранения проб представлен материал по количественному
определению гомоцистеина и других аминотиолов. Обсуждаются возможности применения
различных реагентов с целью повышения чувствительности детектирования аминотиолов
и оптимизации процесса их разделения. Работа содержит обзор опубликованных за
последние десятилетия отечественных и зарубежных исследований по инструментальным
методам анализа аминотиолов с использованием капиллярного электрофореза, высокоэффективной
жидкостной хроматографии и применением различных видов детектирования,
включая масс-спектрометрическое, флуорометрическое и УФ-детектирование.
Для биохимиков, токсикологов, врачей санитарно-эпидемиологической службы и
специалистов клинических лабораторий.
ISBN 978-5-02-039214-4
© Кубатиев А.А., Иванов А.В.,
Лузянин Б.П., 2016
© ФГБНУ НИИ общей патологии
и патофизиологии, 2016
© ФГУП Издательство «Наука», 2016
Стр.3
CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2MEA
2-меркаптоэтиламин
2MC 2-метилцистеин
4-MSA
4-малеимидилсалициловая кислота
ANM анилиннафтилмалеимид
ARM анилинфенилмалеимид
ABD-F 4-аминосульфонил-7-фтор-2,1,3-бензоксидиазол
AcABD-F 4-(N-ацетиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3бензоксидиазол
BIPM
N-[4-(2-бензимидазолил)фенил]-малеимид
bHcy связанный гомоцистеин
CMQTB 2-хлоро-1-метилхинолинтетрафторборат
CMPI 2-хлор-1-метилпиридин иодид
CSF спинномозговая жидкость
Cys цистеин
Cysta
цистатионин
Cys-Gly цистеинилглицин
CV
DTTI дитиотреитол
DTE дитиоэритриол
DTDNA
DTNBA
коэффициент вариации
6,6’-дитиодиникотиновая кислота
5,5’-дитио-бис(2-нитробензойная кислота)
DMANSC 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид
DAM диметиламинофенилмалеимид
dPA
d-пеницилламин
DBPM N-[4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил]
малеимид
DTDP
DBD-F
4,4’-дитиодипиридин
DACM N-(7-диметиламино-4-метил-2-оксо-3-хрометил)
малеимид
4’-(N,N-диметиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3бензоксидиазол
EDTA
калиевая/натриевая соль этилендиаминтетрауксусной
кислоты
3
Стр.4
EOF
электро-осмотический поток (ЭОП)
FITC флуоресцеинизотиоцианат
FM флуоресцеин-5-малеимид
FPIA
GC
флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ
газовая хроматография (ГХ)
GITC 2,3,4,6-тетра-О-ацето-β-D-глюкопиранозил
изотиоцианат
GSH глутатион
Glu-Cys глутамилцистеин
Hcy гомоцистеин
ITC изотиоцианат
IAF иодоацетаминофлуоресцеин
МАТ
метионинаденозинтрансфераза
MCE меркаптоэтанол
MeCys метилцистеин
МEKC мицеллярный капиллярный электрофорез
Met метионин
mBrB монобромбиман
mBrTMAB монобромтриметиламинобиман
MPA
3-меркаптопропионовая кислота
MPG N-(2-меркаптопропионил)глицин
MS
метионинсинтаза
МТ метилтрансфераза
MTBSTFA N-метил-N-(трет-бутил-диметилсилил)трифторацетамид
MTHFR
метилентетрагидрофолатредуктаза
NA-Cys N-ацетилцистеин
NDA
2,3-нафталиндикарбоксиальдегид
NEM N-этилмалеимид
NAM N-(9-акридинил)малеимид
NSHBA
2-нитро-5-сульфгидрилбензойная кислота
NMDG N-метил-D-глюкамин (меглумин)
NPM N-(1-пиринил)малеимид
NG нингидрин
OPA
О-фталальдегид
oxHcy окисленный гомоцистеин
PBS фосфатно-солевой буфер
rHcy восстановленный гомоцистеин
SAH S-аденозилгомоцистеин
SAM S-аденозилметионин
SSA
сульфосалициловая кислота
4
Стр.5
SBD-F аммониум – 7-фтор-2,1,3-бензоксидиазол-4сульфонат
SAMSA
TBP
TCEP
TEA
TFA
TPP
TCAA
флуоресцеин-5((2-(и
3)-S-(ацетилмеркапто)сукцноил)
амино)флуоресцеин
три-n-бутилфосфин
трис-(2-карбоксиэтил)фосфин
триэтиламин
трифторуксусная кислота
трифенилфосфин
TcAcABD 4(N-трихлорацетиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3бензоксадиазол
трихлоруксусная
кислота
TCDI 1,1-тиокарбонилдиимидазол
tHcy общий гомоцистеин
АТФ аденозинтрифосфат
АФК активные формы кислорода
БГМТ бетаин-гомоцистеин метилтрансфераза
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ГГЦ гипергомоцистеинемия
ГМК гладкомышечные клетки
ДГФК дигидрофолиевая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА иммуноферментный анализ
ЛПНП липопротеины низкой плотности
К(З)Э
капиллярный (зонный) электрофорез
(Л)ФД (лазерный) флюоресцентный детектор
МС масс-спектрометрия
НАДФ никотинамиддинуклеотидфосфат
ТГФ тетрагидрофолат
ТЛ тиолактон гомоцистеина
УФ ультрафиолет(овый)
ФК фолиевая кислота
ХПН хроническая почечная недостаточность
ЭХД электрохимический детектор
Стр.6
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений .........................................................................
ВВЕДЕНИЕ .........................................................................................
Часть I
АМИНОТИОЛЫ В ОРГАНИЗМЕ
Глава 1
БИОХИМИЯ АМИНОТИОЛОВ
1.1. Метаболизм гомоцистеина и его регуляция................................
1.2. Химические свойства SH-групп тиолов ......................................
1.3. Аминотиолы и антиоксидантная защита организма ..................
1.4. Гомоцистеин в плазме крови .......................................................
Глава 2
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ
ДЛЯ АНАЛИЗА АМИНОТИОЛОВ
2.1. Общее содержание аминотиолов .................................................
2.2. Свободные и связанные формы аминотиолов ............................
2.3. Оценка «редокс-статуса» аминотиолов .......................................
Глава 3
ФРАКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ В НОРМЕ
И ПАТОЛОГИИ
3.1. Фракции аминотиолов в нормальной плазме .............................
3.2. Аминотиолы плазмы при гипергомоцистеинемии .....................
3.3. «Редокс-статус» тиолов плазмы при сердечно-сосудистых
заболеваниях ................................................................................
3.4. «Редокс-статус» тиолов плазмы при других заболеваниях
(почечная недостаточность, СПИД) ...........................................
8
15
16
18
3
6
23
28
30
31
31
33
37
171
Стр.172
Часть II
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОТИОЛОВ
Глава 4
МЕТОДЫ ПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА
И ДРУГИХ АМИНОТИОЛОВ
4.1. Масс-спектрометрия ....................................................................
4.2. Электрохимическое детектирование ...........................................
46
54
Глава 5
МЕТОДЫ НЕПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОТИОЛОВ
С РАЗДЕЛЕНИЕМ АНАЛИТОВ В ЖИДКОЙ ФАЗЕ .......................... 58
5.1. Основные цели дериватизации и возможности ее осуществления
...........................................................................................
5.2. Реагенты для УФ-детектирования ...............................................
5.2.1. Дисульфиды (DTNBA, DTDP) ..........................................
5.2.2. Тиокарбонилдиимидазол (TCDI) ......................................
5.2.3. Галогениды (CMQTB, CMPI, BCPB) ................................
5.3. Реагенты для флуоресцентного детектирования .......................
5.3.1. N-замещенные малеимиды ................................................
5.3.2. Биманы ................................................................................
5.3.3. Дансилазиридин .................................................................
5.3.4. Галогеносульфонилбензофуразаны ...................................
58
59
59
68
73
77
77
81
91
91
5.3.5. О-фталевый (OPA) и нафталеновый (NDA) диальдегиды 104
5.3.6. Производные флуоресцеина............................................... 105
5.4. Дериватизация для электрохимического детектирования ......... 111
5.5. Реагенты для МС-детектирования .............................................. 112
5.6. Аминокислотный анализатор ...................................................... 117
Глава 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОТИОЛОВ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ ..................................................................................... 119
Глава 7
МЕТОДЫ НЕПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОТИОЛОВ
БЕЗ РАЗДЕЛЕНИЯ ....................................................................................... 125
7.1. Колориметрическое детектирование ........................................... 125
7.2. Иммуноферментный анализ ........................................................ 128
Глава 8
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ S-АДЕНОЗИЛМЕТИОНИНА
И S-АДЕНОЗИЛГОМОЦИСТЕИНА .................................................. 130
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................... 140
ЛИТЕРАТУРА ...................................................................................... 142
Стр.173
Научное издание
Кубатиев Аслан Амирханович
Иванов Александр Владимирович
Лузянин Борис Петрович
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА
Утверждено к печати
Ученым советом ФГБНУ
«Научно-исследовательский институт
общей патологии и патофизиологии»
Редактор Л.В. Филиппова
Художник Ю.И. Духовская
Художественный редактор В.Ю. Яковлев
Технический редактор З.Б. Павлюк
Корректоры Р.В. Молоканова, Е.Л. Сысоева,
Т.А. Печко
Стр.174
Подписано к печати 20.02.2016.
Формат 60 Ч 901/16. Гарнитура Таймс.
Печать офсетная
Усл.печ.л. 11,0. Усл.кр.-отт. 11,5. Уч.-изд.л. 12,6
Тираж 1000 экз. Тип. зак.
ФГУП Издательство «Наука»
117997, Москва, Профсоюзная ул., 90
E-mail: secret@naukaran.ru
www.naukaran.ru
ФГУП Издательство «Наука»
(Типография «Наука»)
121099, Москва, Шубинский пер., 6
Стр.175