Учебная литература ТГМУ
Е.А. Зайцева, Р.Н. Диго
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА ЛИСТЕРИОЗА
Учебное пособие
Издательство «Медицина ДВ»
690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 4
Тел.: (423) 245-56-49. E-mail: medicinaDV@mail.ru
Владивосток
Медицина ДВ
2016
Стр.1
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Тихоокеанский государственный медицинский университет
Е.А. Зайцева, Р.Н. Диго
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА ЛИСТЕРИОЗА
Учебное пособие
Владивосток
Медицина ДВ
2016
Стр.2
УДК 616.98-078(075.9)
ББК 52.649.226я73
З 177
Издано по рекомендации редакционно-издательского совета
Тихоокеанского государственного медицинского университета
Рецензенты:
И.С. Тартаковский – д.б.н., профессор кафедры инфектологии
и вирусологии первого МГМУ им. И.М. Сеченова
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Л.Н. Федянина – д.м.н., профессор кафедры
фундаментальной медицины Школы биомедицины
Дальневосточного федерального университета
Министерства образования Российской Федерации
З 177
Зайцева, Е.А.
Микробиологическая диагностика листериоза : учебное пособие /
Е.А. Зайцева, Р.Н. Диго. – Владивосток : Медицина ДВ, 2016. – 96 с.
ISBN 978-5-98301-082-6
В данном пособии представлены материалы о современных и классических
методах, используемых для выявления, идентификации и типирования листерий.
Изложены сведения о микроскопии бактерий для определения морфологических
и культуральных особенностей листерий, представлены современные
требования и рекомендации по теоретическим аспектам и практической значимости
бактериологического метода диагностики листериоза в научно-исследовательской
работе и клинической практике.
Учебное пособие составлено по программам подготовки кадров высшей
квалификации – программам ординатуры и аспирантуры, по специальностям
Бактериология и Микробиология.
УДК 616.98-078(075.9)
ББК 52.649.226я73
ISBN 978-5-98301-082-6
© Е.А. Зайцева, Р.Н. Диго, ТГМУ, 2016
© «Медицина ДВ», 2016
Стр.3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГРМ
КАМП-тест
МПА
МПБ
ПБЛ
ПЦР
– гидролизат рыбной муки
– метод Christie-Atkins-Munch-Peterson
– мясо-пептонный агар
– мясо-пептонный бульон
– питательный бульон листериозный
– полимеразная цепная реакция
Стр.4
ВВЕДЕНИЕ
Листериоз остается малоизвестен в практическом здравоохранении,
хотя история изучения возбудителя насчитывает более ста лет.
Эта инфекция встречается на всех континентах, в странах с различными
социально-экономическими и климатическими условиями.
До 80-х гг. XX столетия листериоз не привлекал к себе большого
внимания исследователей, поскольку заболеваемость им была невысокой,
проявлялась в разных странах несколькими десятками случаев
в год.
Положение с заболеваемостью листериозом коренным образом
изменилось в 80-х гг., когда в передовых зарубежных странах (США,
Великобритания, Франция, Испания, Италия, Германия и др.) начали
возникать эпидемические вспышки листериоза пищевого происхождения
с тяжелым клиническим течением и летальностью до 24-40%.
В Российской Федерации заболеваемость листериозом официально
регистрируется с 1992 года и до настоящего времени продолжает
оставаться на невысоком уровне, выражающемся 40-100 случаями
в год при отсутствии эпидемических вспышек. В связи с тем, что листериоз
является в настоящее время все еще редко диагностируемым
заболеванием и не всегда регистрируется, истинная распространенность
этой инфекции среди людей неизвестна.
Редкая регистрация листериоза связана с недостаточным уровнем
как клинической, так и лабораторной диагностики. Этим объясняется
актуальность проблемы листериоза. Она связана и с увеличением
количества иммуносупрессивных больных, людей со
сниженным Т-клеточным звеном иммунитета, которых наиболее
часто поражает этот возбудитель. Прежде всего это – беременные
женщины, люди, страдающие онкологическими заболеваниями; инфицированные
вирусом иммунодефицита (ВИЧ-инфекция); лица,
длительное время получавшие антибактериальные, кортикостероидные
препараты; люди пожилого и старческого возраста, у которых
регистрируются наиболее тяжелые формы болезни – септическая
и менингоэнцефалитическая; дети до 1 года. В последние годы категорию
риска дополняет большая группа молодых лиц – наркоманов,
зависимых от внутривенно вводимых наркотиков. Во всех этих
случаях присоединяющийся листериоз часто является последним
4
Введение
Стр.5
звеном, приводящим к смертельному исходу. Поэтому в России возникла
естественная необходимость активизировать работу по лабораторной
диагностике листериоза и усилить ее в направлении повышения
профилактики инфекции.
В этой связи становится весьма актуальным применение и усовершенствование
селективных, дифференциальных питательных сред
для изоляции и идентификации листерий из биологических материалов
и окружающей среды, для разработки новых подходов к их типированию
с целью выявления наиболее значимых, вирулентных штаммов
листерий в инфекционной патологии. Представленные в данном
учебном пособии материалы способствуют решению этих вопросов.
Эти материалы включают цветные фотографии (сделанные авторами
и заимствованные) различных сред, рекомендованных ГОСТ и международным
стандартом ISO 11290-1, для изоляции и типирования
листерий, широко используемых, как в нашей стране, так и за рубежом,
а также собственные авторские разработки.
Учебное пособие предназначено для ординаторов и аспирантов,
обучающихся в системе послевузовского профессионального образования
по специальностям Бактериология и Микробиология.
Стр.6
1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЛИСТЕРИОЗЕ
1.1. ЭПИДЕМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛИСТЕРИОЗА
Бактерии рода Listeria широко распространены в природе. Эти
микроорганизмы, обладая обширными адаптационными возможностями,
способны обитать как в организме человека и теплокровных
животных, так и в разнообразных объектах окружающей среды (в почве,
воде, растениях).
Возбудитель листериоза хорошо адаптирован к влажным, богатым гумусом
почвам с реакцией среды близкой к нейтральной. Листерии активно
размножаются в почве весной и осенью. Зимнее промерзание почвы
не оказывает отрицательного влияния на их жизнеспособность, а высокие
летние температуры возбудитель может переживать в L- и R-формах.
Обладая уникальными экологическими возможностями, листерии
имеют широкий круг хозяев, существенно отличающихся друг от
друга как филогенетически, так и экологически.
Листериозный микроб выделен из различных видов диких и домашних
млекопитающих – овец, коз, крупного рогатого скота, свиней,
лошадей, собак, кошек, птиц, рыб, ракообразных, членистоногих и насекомых.
Они найдены у зайцев, леммингов, лисиц, песцов, енотов.
Чаще всего L. monocytogenes обнаруживается у овец, реже – у свиней
и крупного рогатого скота. Лошади могут быть носителями не только
L. monocytogenes, но и других видов листерий. Животные заражаются
через воду и корма, инфицированные листериями, от грызунов или их
трупов. Определенную роль в поддержании стационарных очагов болезни
играют кровососущие насекомые, особенно пастбищные клещи.
Заражаясь от грызунов и других больных животных, они способствуют
распространению инфекции, передавая бактерии другим животным.
Листерии могут персистировать в кишечнике практически здоровых
людей и животных (от 5 до 90% особей являются носителями микроба).
В результате широкого распространения в природе, листерии стали
частью микробной экосистемы окружающей среды в местах приготовления
и обработки пищевых продуктов, и поэтому они могут попадать
в различные продукты питания, а, следовательно, в организм человека.
Листериоз до 1960 г. у людей был редкостью. Однако в 80-х годах
20-го столетия о листериозе стали говорить как о пищевой инфекции.
Были зафиксированы крупные вспышки листериоза людей с высоким
6
Современные представления о листериозе
Стр.7
процентом смертельных исходов (30-40%) при употреблении пищевых
продуктов животного и растительного происхождения. С этого
времени ежегодно в мире регистрируются тысячи заболевших листериозом.
Эта инфекция встречается на всех континентах земного шара,
о чем свидетельствуют заболевания людей в Европе, Азии, Африке,
Южной и Северной Америке.
Отчасти это сопряжено с изменением рациона питания, появлением
новых технологий, связанных с производством «удобных продуктов питания»,
которые не всегда гарантируют санитарное качество пищи. Еще
одна причина распространения данного заболевания – постоянно разрастающаяся
сеть пунктов общественного питания – кафе, ресторанов, закусочных,
столовых, бистро и др. Нельзя исключить еще одну причину возможного
создания очага листериоза – это бесконтрольное использование
стоков мясоперерабатывающих предприятий, использование органических
удобрений от животных, являющихся носителями листерий и т.д.
Выявлены спорадические случаи листериоза человека, отдельные
локальные вспышки этого заболевания и случаи контаминации листериями
продуктов питания в ряде стран Африки, Азии и Южной Америки.
В США ежегодно диагностируется около 1850 спорадических
случаев. Чаще всего спорадические случаи листериоза обнаруживают
у детей до одного года (более 50%) и у лиц старше 60 лет (около 30 %).
В Великобритании ежегодно выявляют около 300 случаев листериоза
как среди взрослых, так и среди новорожденных. Широкое распространение
листерий в объектах окружающей среды, многообразие клинических
проявлений затрудняют установление этиологии и проведение
эпидемиологического анализа спорадических случаев листериоза.
Из шести известных видов листерий потенциально патогенными
для человека и животных считаются два – L. monocytogenes и L. ivanovii.
Механизмы заражения людей многообразны. Инфицирование
человека листериями происходит преимущественно алиментарным
путем через различные продукты питания (сыры, молоко, мясо, рыбу,
овощи и т.д.) на любом этапе их получения, обработки и хранения без
участия животных в цикле передачи.
Листерии обнаружены в молоке и молочных продуктах, мясе животных
и птиц, овощах, салатах и морских продуктах. Ведущую роль
среди них играют молочные продукты, главным образом, непастеризованное
или некачественно пастеризованное молоко и изготовленные
из него мягкие и рассольные сыры.
Из всех пищевых продуктов именно сыры чаще всего заражены
листериями и представляют наибольшую опасность как фактор переСовременные
представления о листериозе
7
Стр.8
дачи инфекции для человека. Наиболее часто листерии выделяются
из определенных видов сыров: с красной слизью; твердых сыров,
особенно – белых ноздреватых, покрытых красной оболочкой, и, так
называемых, «сыров с голубой плесенью». Сливочное масло также может
обеспечивать среду для сохранения и роста бактерий рода Listeria,
включая L. monocytogenes.
К числу
субстратов,
способствующих
поддержанию
роста
L. monocytogenes, которые попадают из окружающей среды, относятся
нарезанные овощи, мягкие сыры, поверхность мясных продуктов. Из
овощей листерии чаще контаминируют картофель и редис.
Многочисленные случаи выделения листерий установлены из сырого
мяса забитых животных (говядина, свинина, баранина) и домашней
птицы. Обнаруживаются L. monocytogenes в вареных сосисках, сыровяленых
и сырокопченых мясопродуктах, готовых к употреблению продуктах
из птицы, полуфабрикатах для еды «быстрого приготовления».
L. monocytogenes выделяются из широкого спектра морепродуктов
– замороженных креветок, лобстеров, консервированного и свежего
крабового мяса, копченой и маринованной рыбы и т.д. Живая
рыба может заражаться патогенными листериями в местах естественного
обитания в экологически неблагополучных районах, где сточные
бытовые воды и стоки животноводческих ферм, содержащих листерии,
сбрасываются без очистки непосредственно в районы вылова
рыбы. Тепловая обработка рыбного сырья позволяет освободить его
от патогенных листерий. Однако при холодном копчении соль и коптильный
раствор способствуют размножению листерий. Поэтому
чаще всего L. monocytogenes выделяются из рыбы холодного копчения.
Причиной высокой степени зараженности конечной продукции коптильных
производств является и вторичная контаминация рыбы на
производстве в ходе технологического процесса.
Имеется ряд продуктов, где листерии не обнаруживаются – это
йогурты (промышленного производства), твердые сыры, шоколад,
мармелад, печенье, сырые яблоки и томаты. К настоящему времени
выявлены и изучены далеко не все пищевые продукты, которые могут
служить потенциальными источниками заражения, и далеко не все
возможные механизмы контаминации этих продуктов.
Кроме пищевого, возможен аэрогенный путь заражения при обработке
животного сырья (шерсти, щетины, кожи, шкур, пера, пуха).
Встречается контактный путь передачи листерий – через порезы
и ссадины на коже при попадании в них различных выделений больных
животных. Возможна передача бактерий от человека к человеку,
8
Современные представления о листериозе
Стр.9
описаны случаи заражения половым путем. C конца 20 века листериоз
стали рассматривать как внутрибольничную инфекцию.
Наибольшему риску заражения листериозом подвергаются беременные
женщины, их плоды и новорожденные. Беременные женщины
заболевают листериозом в 20 раз чаще, чем другие здоровые люди.
Риск развития листериоза более высок при многоплодной беременности.
Листерии имеют своеобразный тропизм к мочеполовой системе
женщин и, особенно к тканям эмбрионов.
Большую опасность листериоз представляет для лиц с низкими показателями
Т-клеточного звена иммунитета, при этом 90% заболевших
нуждаются в госпитализации. Это люди, страдающие онкологическими
заболеваниями; инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита
(ВИЧ); лица, длительное время получавшие антибактериальные, кортикостероидные
препараты. Чаще листериозом болеют люди с нарушениями
иммунитета в результате предшествующих болезней. В последние
годы категорию риска дополняет большая группа молодых лиц – наркоманов,
зависимых от внутривенно вводимых наркотиков. Во всех этих
случаях присоединяющийся листериоз служит последним звеном, приводящим
к смертельному исходу. Наблюдаемое в последнее время увеличение
доли лиц пожилого возраста и людей с той или иной формой
иммунной недостаточности приводит к увеличению числа тех, кто относится
к группе повышенного риска заражения листериозом.
Заболеваемость листериозом может носить профессиональный
характер среди работников животноводческих и птицеводческих хозяйств,
а также цехов первичной переработки на мясо- и птицекомбинатах.
К группе риска следует отнести звероводов, пастухов, чабанов,
зооветперсонал, которые заражаются листериями в процессе ухода за
больными животными, помощи при родах, соприкосновения с абортированными
плодами и т.д.
1.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
Согласно определителю бактерий Берджи род Listeria относится
к 19-й группе микроорганизмов – грамположительные неспорообразующие
палочки правильной формы. В настоящее время выделяются
6 видов бактерий, относящихся к роду Listeria – L. monocytogenes,
L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi.
Строение клеточной стенки L. monocytogenes типично для грамположительных
бактерий. Ее основой является пептидогликан, в состав
которого входят углеводы, тейхоевые кислоты, липопротеины и поверхностные
белки.
Современные представления о листериозе
9
Стр.10