Научная литература ТГМУ
Е.В. Просекова, Н.Р. Забелина, В.А. Сабыныч
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
Издательство «Медицина ДВ»
690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 4
Тел.: (423) 245-56-49. E-mail: medicinaDV@mail.ru
Владивосток
Медицина ДВ
2016
Стр.1
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Тихоокеанский государственный медицинский университет
Е.В. Просекова, Н.Р. Забелина, В.А. Сабыныч
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
Учебное пособие
Рекомендовано Координационным советом по области образования
«Здравоохранение и медицинские науки» в качестве учебного пособия
для обучающихся по основным профессиональным образовательным
программам высшего образования – программам ординатуры
по специальности Клиническая лабораторная диагностика
Владивосток
Медицина ДВ
2016
Стр.2
УДК 616-074/-078(075.8)
ББК 53.4я7
П 822
Издано по рекомендации редакционно-издательского совета
Тихоокеанского государственного медицинского университета
Рецензенты:
Ю.С. Хотимченко – д.б.н., профессор, директор школы биомедицины
Дальневосточного федерального университета
Министерства образования и науки Российской Федерации
Т.Ф. Боровская – д.м.н., профессор кафедры биологической химии
и клинической лабораторной диагностики
Дальневосточного государственного медицинского университета
Министерства здравоохранения Российской Федерации
П 822
Просекова, Е.В.
Иммунологические методы исследования в клинической лабораторной
диагностике : учебное пособие / Е.В. Просекова, Н.Р. Забелина,
В.А. Сабыныч. – Владивосток : Медицина ДВ, 2016. – 120 с.
ISBN 978-5-98301-070-3
В учебном пособии отражены современные подходы к патогенетическому
принципу иммунологических методов исследования, представлены современные
требования и рекомендации по теоретическим аспектам и практической
значимости иммунологических методов в многопрофильной научно-исследовательской
работе и клинической практике, рассмотрены особенности контроля
их качества.
Учебное пособие составлено в соответствии с требованиями Федеральных
государственных образовательных стандартов и предназначено для клинических
интернов и ординаторов по специальности Клиническая лабораторная диагностика.
УДК
616-074/-078(075.8)
ББК 53.4я7
ISBN 978-5-98301-070-3
© Коллектив авторов ТГМУ, 2016
© «Медицина ДВ», 2016
Стр.3
Список сокращений
АГ
АТ
АГ-АТ
АОК
ВПГ
ВВЗ
ВЭБ
ГВИ
ДНК
ИА
ИФА
ИХЛА
НИФ
ПИФ
РА
РИФ
РП
РГА
РТГА
РНГА
РПГА
РН
РТН
РИА
РМП
РБО
РТБО
РГадс
РТГадс
ЦП
ЦПД
РТ ЦПД
– антиген
– антитело
– комплекс антиген-антитело (иммунный комплекс)
– антителообразующая клетка
– вирус простого герпеса
– вирус Варицеллазостер
– вирус Эпштейн-Барра
– герпесвирусные инфекции
– дезоксирибонуклеиновая кислота
– индекс авидности
– иммуноферментный анализ
– иммуннохемилюминесцентный анализ
– непрямая иммунофлюоресценция
– прямая иммунофлюоресценция
– реакция агглютинации
– реакция иммунофлюоресценции
– реакция преципитации
– реакция гемагглютинации
– реакция торможения гемагглютинации
– реакция непрямой гемагглютинации
– реакция пассивной гемагглютинации
– реакция нейтрализации
– реакция торможения нейтрализации
– радиоимунный анализ
– реакция микропреципитации
– реакция бляшкообразования
– реакция торможения бляшкообразования
– реакция гемадсорбции
– реакция торможения гемадсорбции
– цветная проба
– цитопатогеное действие
– реакция торможения цитопатогенного действия
Стр.4
РТЦП
TCR-Т
ЦМВ
CD4
EBNA IgM
VCA IgM
Fab
PAMP
– реакция торможения цветной пробы
– лимфоцита клеточный рецептор
– цитомегаловирус
– Т-хелперы
IgM, IgG, IgA – иммуноглобулины А, М, G
IgG EA
NK
– натуральные киллеры
– фрагмент антитела
– иммуноглобулины к нуклеиновому антигену
– иммуноглобулины к раннему антигену
– иммуноглобулины к капсидному антигену
– Pathogen-associatedmolecularpatterns –
патогенассоциированные молекулярные паттерны
Стр.5
Введение
Иммунная система человека обладает способностью выработки специфичных
молекул антител к различным по своей индивидуальности
антигенам. Уникальность иммунной системы состоит в том, что в ней
заложены регуляторные функции, которые позволяют при наличии
каждого конкретного антигена, являющегося пусковым механизмом
иммунного ответа, реагировать нестандартно в соответствии с индивидуальными
особенностями организма и системы иммунитета.
Иммунитет можно описать как систему своеобразных защитных
реакций, обеспечивающих надзор за антигенным составом внутренней
среды организма человека, основанную на наличии распознающих молекул
и связанную с формированием неординарной памяти.
Лабораторная диагностика, основанная на специфическом взаимодействии
антигенов и антител, позволяющая выявлять как антитела, так
и антигены, широко используется в практической медицине. Эти реакции
обозначили как серологические – от латинского serum – сыворотка
и logos – учение. В настоящее время для названия методов исследования
с использованием принципа специфической реакции взаимодействия
антигена и антитела применяют термин иммунологические при единичном
сохранении в научной литературе названия серологические.
В клинической диагностической лаборатории с помощью этих методов
исследования определяют группы крови, диагностируют инфекционные
и паразитарные заболевания, выявляют регуляторные белки,
клеточные структуры, тканевые и опухолевые антигены, визуализируют
процессы сенсибилизации и аутоиммунное воспаление, гормональные
нарушения, проводят фенотипирование клеток.
Исторически феномен образования иммунных комплексов «антиген-антитело»
был зарегистрирован бактериологами без объяснения
и расшифровки иммунных механизмов специфичности этой реакции.
Сыворотка человека, перенесшего заболевание, давала видимую реакцию
склеивания с бактериями, вызвавшими данное заболевание. Этот
феномен был назван «агглютинация».
Введение
5
Стр.6
Образование комплекса «антиген–антитело» происходит между антигенными
детерминантами и Fab-фрагментом антитела. Связь между
детерминантами и активным центром обеспечивается разными механизмами:
1.
Электростатическими силами – притяжение между двумя
противоположно заряженными ионизированными группами (NH3+
и СОО).
2.
Водородными связями – между ОН, NН2 и СООН гидрофильными
группами.
3. Гидрофобными взаимодействиями – при соприкосновении гидрофобных
групп белков в воде наступает их взаимное притяжение.
4. Вандерваальсовыми силами – взаимодействие внешних электронных
облаков, зависящее от площади контакта АГ и АТ и встречи
зарядов противоположного знака.
Сила и прочность связи в иммунном комплексе между АГ-АТ варьируют
в зависимости от характеристик и природы участников реакции
и могут быть прочными и непрочными. Более прочному связыванию
способствуют большее количество антигенных детерминант
в антигене, количественное соотношение антигена и антитела (реакция
становится результативнее при эквивалентном их соотношении), последовательность
расположения концевых групп аминокислот в детерминанте,
наличие в детерминанте ароматических аминокислот, а также
аффинность и авидность антитела.
Антитела, применяемые в иммунных реакциях выявления антигена,
входят в состав иммунных сывороток. Иммунные сыворотки ранее
готовились путем иммунизации животных: баранов, ослов, кроликов,
лошадей соответствующими антигенами. После выработки специфических
антител у иммунизированного животного венепункцией забирали
кровь, отделяли сыворотку от клеточной массы и определяли титр искомых
антител.
В настоящее время иммунные сыворотки готовят с использованием
гибридомной технологии. Гибридома вырабатывает моноклональные
антитела. Принцип применения технологии гибридомы состоит в том,
что у иммунизированной мыши из селезенки выделяется антителообразующая
клетка (АОК или плазмоцит), способная вырабатывать антитела
с одинаковыми свойствами. Эту клетку объединяют с опухолевой
клеткой (выделенной из В-лимфомы), получая гибридную клетку, которая
может одновременно вырабатывать антитела и быть бессмертной.
Гибридомные технологии в настоящее время позволяют получать моноклональные
антитела к широкому спектру антигенов.
6
Введение
Стр.7
Иммунные реакции, используемые в клинической лабораторной
диагностике, в зависимости от механизмов и принципов визуализации
классифицируют:
• на двухкомпонентные с применением только антигенов и антител
– реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации. Регистрация
результатов в этих реакциях происходит визуально,
иммунный комплекс образуется между корпускулярным антигеном
и антителами, преимущественно представленными высоковалентными
иммуноглобулинами М (IgМ);
• на реакции с использованием антигена, антитела и «метки»,
присоединяемой к одному из них, для визуализации и регистрации
оптическими или иными приборами – иммунофлюоресцентный,
радиоиммунный, иммуноферментный, иммунохемилюминесцентный,
метод иммуноблотинга и др. Необходимость
привлечения дополнительных средств визуализации объясняется
тем, что результат реакции с образованием иммунного комплекса
между растворимыми антигеном и антителом не визуализируется,
а метка служит маркером завершенной реакции и количественно
фиксируется с помощью аппаратуры. В зависимости от
природы используемой метки применяют разные приборы учета
результата реакции: для флюоресцентной метки – флюоресцентный
микроскоп, цитофлюориметр, для радиоактивной – счетчик
радиоактивности, для ферментной – измерение оптической плотности
раствора.
Введение
7
Стр.8
Глава I
Основные понятия,
термины и определения
Аккредитация клинической диагностической лаборатории – это
процедура официального установления компетентности лаборатории
в клинической диагностике.
Аналитическая система – полная совокупность измерительных
приборов и другого оборудования, объединенных для выполнения
специальных измерений, которая включает в себя также химические
и биологические вещества и другие материалы.
Аналитическая серия – совокупность измерений лабораторного
показателя, выполненных в одних и тех же условиях без перенастройки
и калибровки аналитической системы, при которых характеристики
аналитической системы остаются стабильными.
Аналитические характеристики лабораторного метода исследования:
Аналитическая
чувствительность метода – способность определять
возможно малые количества аналита.
Аналитическая специфичность метода – способность определять
содержание только того вещества, для выявления которого этот
метод предназначен.
Воспроизводимость измерения (precision) – качество, отражающее
близость результатов измерений, выполненных практически в одинаковых
условиях.
Диагностическая специфичность – частота негативных результатов
у практически здоровых людей.
Диагностическая чувствительность – частота патологических
результатов при обследовании пациентов с определенной патологией.
Правильность измерения (accurasy) – качество, отражающее близость
полученного результата к истинному значению измеряемой концентрации
вещества.
Основная функция иммунной системы состоит в защите организма
от биологической агрессии, исходящей, как правило, извне от патогенов
и их продуктов, чужеродных для макроорганизма. В качестве
маркеров чужеродности рассматривают антигены.
8
Глава I
Стр.9
Антигены – биологические тела и молекулы (высокомолекулярные
соединения), несущие признаки чужеродной генетической информации,
способные специфически стимулировать иммунокомпетентные
лимфоидные клетки и обеспечивать развитие иммунного
ответа (англ. – antigen от antibody-generator – «производитель антител»).
Чужеродность антигена проявляется относительно конкретного организма
– молекула, воспринимаемая как антиген одним организмом,
может не восприниматься в качестве такового другим организмом.
Антигены – это любые простые или сложные вещества, которые
при попадании в организм тем или иным путем вызывают иммунную
реакцию и способны своеобразно взаимодействовать с продуктами
этой реакции: антителами и иммунными Т-клетками. Иммуногенность
молекул антигена во многом определяется наличием в их составе
PAMP – патогенассоциированных молекулярных паттернов. По
происхождению различают четыре группы АГ: природные; модифицированные;
синтетические; гаптены. Виды антигенов: экзогенные
(инфекционные и неинфекционные); эндогенные. Инфекционные –
включают антигены бактерий, вирусов, грибов и простейших. Бактериальные
антигены подразделяются на группоспецифические, видоспецифические,
типоспецифические. Неинфекционные антигены
состоят из аллергенов растений и лекарств, химических, природных,
синтетических и других аллергенов, а также антигенов эритроцитов
и лейкоцитов. Антигенами для иммунных реакций могут быть бактерии,
вирусы, клетки, аллергены различной природы, рекомбинантные
антигены бактерий, вирусов. Для иммунных реакций в лабораторных
исследованиях данные препараты называются диагностикумами, готовятся
разными методами: фракционированием, осаждением, очисткой
и т.д.
Антигены обладают следующими свойствами: чужеродностью,
антигенностью, иммуногенностью, специфичностью.
Антигенность – мера, по которой определяют качество АГ. На
введение различных АГ один и тот же организм вырабатывает разное
количество антител (АТ). Чем больше выработка АТ, тем выше антигенность
АГ.
Антигены, которые позволяют различать особи или группы особей
животных одного вида, называют изоантигенами.
При присоединении к молекуле белка группы, обеспечивающей
новую иммунологическую специфичность, получают антигены, названные
конъюгированными. При введении животным этих АГ, содержащих
разные химические группировки, вырабатываются АТ,
Основные понятия, термины и определения
9
Стр.10